[發明專利]人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚體的檢測方法

有效

• 申請號: 201810315107.3
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108732228B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 杜晞;曹海軍;馬莉;王宗奎;葉生亮;李長清;劉鳳娟;張容;陳云華;劉欣晏
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N21/76
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及一種人凝血因子FⅧ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，依次包括膠制備、電泳、膜和濾紙處理、濕轉、封閉、抗體孵育和顯色等步驟，其特征在于：所述電泳步驟為連續垂直瓊脂糖電泳，并在顯色步驟后增加了定量分析步驟用以準確分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚體的質量。所述定量分析步驟為用凝膠分析軟件計算供試品和混合血漿中每個條帶相對含量，并以供試品中每個條帶的相對含量與混合血漿中每個條帶的相對含量的比值來做為評估血管性血友病因子多聚體質量的標準。本發明中可定量分析FⅧ制品中血管性血友病因子多聚體組成，從而評估FⅧ制品中vWF的質量，為FⅧ/vWF制品用于vWD的治療提供理論依據。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，涉及人凝血因子Ⅷ制品(Human CoagulationFactor Ⅷ，以下簡稱FⅧ制品，)中血管性血友病因子(von Willebrand Factor，以下簡稱vWF) 多聚體組成的檢測方法。

背景技術

FⅧ制品是由健康人血漿分離提純而來，以FⅧ為主要藥物成分的血漿蛋白制品，在臨床上主要用于治療先天缺乏FⅧ的甲型血友病。而在生產過程中vWF與FⅧ不易分開，大部分FⅧ制品中都含有vWF，因此FⅧ制品也用于治療von Willebrand病，一種vWF數量減少或質量異常導致的出血性疾病。FⅧ制品中的vWF主要有2個功能：一個是作為FⅧ的載體保護FⅧ不被降解，另一個是介導血小板黏附于損傷的血管壁并誘導血小板聚集，發揮止血功能。vWF在血漿中以多聚體形式存在，分為高分子量多聚體(含有11-20個二聚體)，中分子量多聚體(含有5-10個二聚體)和低分子量多聚體(含有1-5個二聚體)。

研究表明盡管所有分子量的vWF均有FⅧ載體功能，但vWF的止血功能與vWF多聚體分子量大小有關，只有高分子量vWF多聚體具有較強的血小板結合能力，中分子量vWF多聚體僅有較低的血小板結合能力，而低分子量vWF多聚體不具有與血小板結合的能力。因此用于治療vWD的FⅧ制品必須含有高分子量和中分子量vWF多聚體。在評估FⅧ制品是否可用于治療vWD時，需對FⅧ制品進行vWF多聚體分析。

傳統的vWF多聚體分析方法常用SDS-瓊脂糖電泳和Western blot來分析，包括以下幾個步驟：(1)進行不連續水平板SDS-瓊脂糖電泳，大約需6-8小時。(2)進行濕轉移，電轉時間12-20h。(3)進行一抗、二抗孵育和底物顯色，大約需要16h。傳統的vWF多聚體分析方法操作復雜、耗時長，需要3-5天，且未進行定量分析，因此不適合用于分析FⅧ制品中vWF多聚體組成。

發明內容

本發明的目的是克服現有檢測技術所存在的上述不足，建立一種快速靈敏，可定量分析 FⅧ制品中vWF多聚體組成的方法，該方法適用于定量分析FⅧ制品中vWF多聚體組成；克服了傳統方法中水平板瓊脂糖電泳耗時長及不連續的垂直板瓊脂糖電泳在制備過程中操作非常困難的技術問題。

解決以上技術問題的本發明中的一種人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚體的檢測方法，依次包括膠制備、電泳、膜和濾紙處理、濕轉、封閉、抗體孵育和顯色步驟，其特征在于：所述電泳步驟為連續垂直瓊脂糖電泳，并在顯色步驟后增加了定量分析步驟用以準確分析FⅧ制品中vWF多聚體的質量。所述定量分析步驟為用凝膠分析軟件計算供試品和混合血漿中每個條帶相對含量，并以供試品中每個條帶的相對含量與混合血漿中每個條帶的相對含量的比值來做為評估vWF多聚體質量的標準。

本發明中方法為連續的垂直板瓊脂糖電泳，容易操作，減少制膠步驟。

所述電泳步驟與膜和濾紙處理步驟之間還有浸泡洗滌步驟，即膠取出后，用1mMβ-巰基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min，在電泳緩沖液中放置15min。

電泳結束后，用β-巰基乙醇處理膠，使膠上所有條帶都裂解為單體，再進行電轉移，提高轉膜效率。