[發明專利]人凝血因子Ⅷ制品中vWF多聚體的檢測方法

有效

• 申請號: 201810315107.3
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108732228B
• 公開（公告）日: 2020-08-28
• 發明（設計）人: 杜晞;曹海軍;馬莉;王宗奎;葉生亮;李長清;劉鳳娟;張容;陳云華;劉欣晏
• 申請（專利權）人: 中國醫學科學院輸血研究所
• 主分類號: G01N27/447
• 分類號: G01N27/447;G01N21/76
• 代理公司: 成都高遠知識產權代理事務所(普通合伙) 51222
• 代理人: 李高峽;張娟

1.一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，依次包括膠制備、電泳、膜和濾紙處理、濕轉、封閉、抗體孵育和顯色步驟，其特征在于：所述電泳為連續垂直瓊脂糖電泳，并在顯色步驟后增加了定量分析步驟用以準確分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的質量；所述定量分析步驟為用凝膠分析軟件計算供試品和混合血漿中每個條帶相對含量，并以供試品中每個條帶的相對含量與混合血漿中每個條帶的相對含量的比值來作為評估血管性血友病因子多聚體質量的標準；

所述電泳為將處理好的樣品加入上樣孔，在電泳緩沖液中電泳；電泳條件為：恒流10mA, 2-2.5h，直至溴酚藍跑出玻璃板，結束電泳；

所述電泳與所述膜和濾紙處理步驟之間還有浸泡洗滌步驟，即膠取出后，用1 mMβ-巰基乙醇浸泡5min后用PBS-T洗3次，每次5min,在冰冷的濕轉緩沖液中放置15min；

所述定量分析步驟中，將供試品中第5條帶之后的條帶合在一起分析，并以混合血漿作為標準對照分析人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體組成，即用供試品中每個條帶的相對含量與混合血漿中每個條帶的相對含量的比值來評估血管性血友病因子多聚體的質量，用百分比表示來反映血管性血友病因子多聚體的質量。

2.根據權利要求1所述的一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，其特征在于：所述膠制備為將瓊脂糖溶于緩沖液中，加熱至沸騰，倒入垂直玻璃板中，插入梳子制造上樣孔，放置一段時間待膠凝固。

3.根據權利要求2所述的一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，其特征在于：所述瓊脂糖濃度為1%-1.2%，緩沖液為連續凝膠緩沖液，具體配方包括：30%甘油，50mM Tris，0.384M Gly和0.1%SDS。

4.根據權利要求1所述的一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，其特征在于：所述樣品為待測的人凝血因子Ⅷ制品和作為標準對照的混合血漿；待測的人凝血因子Ⅷ制品和混合血漿用純水將其稀釋至血管性血友病因子抗原（vWF：Ag）含量1IU/ml，再與上樣緩沖液按1:4的比例混合,最后加入溴酚藍使其終濃度為0.005%；所述上樣緩沖液包括9M尿素，4mM EDTA，50mM Tris，2% SDS, 上樣緩沖液pH為6.8。

5.根據權利要求1所述的一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，其特征在于：所述電泳緩沖液的具體配方包括50mM Tris，0.384M Gly，0.1%SDS，電泳緩沖液pH為8.3；所述濕轉緩沖液的具體配方包括2.5mM Tris, 19.2mM Gly，0.1%SDS，濕轉緩沖液pH為8.8。

6.根據權利要求1所述的一種人凝血因子Ⅷ制品中血管性血友病因子多聚體的檢測方法，其特征在于：所述顯色步驟為PBS-T洗膜5次，每次5min；然后膜與發光試劑盒中混合液充分接觸,采用超靈敏化學發光成像儀捕捉信號；將膜上有蛋白的那面朝下與發光試劑盒混合液充分接觸30s-2min。