[發(fā)明專利]基于愈傷組織誘導建立馬藺高頻再生體系方法有效
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810314243.0 | 申請日： | 2018-04-10 |
| 公開（公告）號： | CN108496800B | 公開（公告）日： | 2021-07-16 |
| 發(fā)明（設計）人： | 張興;曲彥婷;王書可;唐煥偉;陳菲;李黎;韓輝;熊燕;石朔宇;韓廷蔚;陳穎;張洪運;李虹;楊軼華;孫波;曲線 | 申請（專利權）人： | 黑龍江省科學院自然與生態(tài)研究所;蘇州科技大學 |
| 主分類號： | A01H4/00 | 分類號： | A01H4/00 |
| 代理公司： | 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465 | 代理人： | 崔自京 |
| 地址： | 150040 黑龍*** | 國省代碼： | 黑龍江;23 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 組織 誘導 建立 馬藺 高頻 再生 體系 方法 | ||
1.一種基于愈傷組織誘導建立馬藺高頻再生體系方法，其特征是：包括以下幾個步驟：
1)外植體篩選：春季選擇馬藺健康植株展葉的葉片，選取葉片中間位置，剪下作為外植體；
2)外植體消毒：將葉片置于裝有清水的200mL燒杯中，加入2-3滴洗潔精，燒杯口套上紗網后，采用自來水洗凈后，加適量洗潔精在自來水處保持沖洗狀態(tài)30-40分鐘，用濾紙吸干水分；在燒杯中加入質量百分比濃度10％次氯酸鈉溶液，使外植體材料完全浸泡其中，加入2滴吐溫20(Tween20)制成消毒液，輕輕搖晃，15-20分鐘后倒掉燒杯中所有消毒液，向燒杯中倒入經過高溫高壓滅菌的無菌水沖洗外植體材料4次，無菌水使用遵循先少后多原則，清洗至燒杯表面沒有泡沫后，倒掉燒杯中無菌水，連帶燒杯放置于超凈工作臺上；
3)接種：將消毒好的葉片材料用已消毒濾紙吸干，葉片切成小正方形，尺寸為：0.5cm×0.5cm，將切成小方形的葉片平行置于基本培養(yǎng)基MS上，培養(yǎng)時間15天，培養(yǎng)室內溫度為24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內黑暗時間12小時，光照強度為2000-2200Lux，Lux為：照度的國際單位；
4)愈傷組織不定芽誘導：篩選步驟3)中MS培養(yǎng)基中葉片無污染、葉片邊緣膨大的部分，轉接于第一培養(yǎng)基上，所述第一培養(yǎng)基構成為：基本培養(yǎng)基MS附加0.02mg/L萘乙酸(NAA)、2.0mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)和1.0mg/L 2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)；蔗糖30g/L；瓊脂粉5g/L；pH6.0；培養(yǎng)30天，葉片誘導出綠色、致密的愈傷組織，培養(yǎng)45-50天時，葉片誘導的愈傷組織的芽點處長出許多不定芽，培養(yǎng)室內溫度為24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內黑暗時間12小時，光照強度為2000-2200Lux，Lux為：照度的國際單位；
5)增殖培養(yǎng)：將愈傷組織誘導的不定芽以2-3個為一叢分別切下來，轉接于第二培養(yǎng)基上，所述培養(yǎng)基構成為：基本培養(yǎng)基MS附加0.02mg/L萘乙酸(NAA)、2.0mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)和1.0mg/L激動素(KT)；蔗糖30g/L；瓊脂粉5g/L；pH6.0；培養(yǎng)室內適宜溫度為24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內保持黑暗12小時，光照強度為2200Lux，不定芽開始萌發(fā)側芽，培養(yǎng)35天，分別切下側芽接種于第三培養(yǎng)基上，所述第三培養(yǎng)基構成為：基本培養(yǎng)基MS附加0.05mg/L萘乙酸(NAA)和3mg/L 6-芐基腺嘌呤(6-BA)；蔗糖30g/L；瓊脂粉5g/L；pH6.0；培養(yǎng)室內溫度為24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內黑暗時間12小時，光照強度為2200Lux；培養(yǎng)30-35天，每叢不定芽都萌發(fā)出6-10個小側芽；在種苗產業(yè)化生產中，此步驟重復進行，當不定芽重復增殖培養(yǎng)第5次時，側芽數量繼續(xù)增長，但會出現變異芽，要及時切除，保持種苗的遺傳性狀穩(wěn)定性；當增殖培養(yǎng)超過4次，要適當降低培養(yǎng)基中6-芐基腺嘌呤(6-BA)和萘乙酸(NAA)濃度，6-BA濃度調整為1.5mg/L，NAA濃度調整為0.01mg/L，避免玻璃化及芽變異；
6)組培苗復壯：將側芽單獨剪切后轉接到基本培養(yǎng)基MS中，培養(yǎng)20-25天長成獨立復壯苗，復壯苗最長葉長2cm時即可轉入生根培養(yǎng)基中，培養(yǎng)室內24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內保持黑暗12小時，光照強度為2000-2200Lux；
7)根誘導：將復壯苗轉接至第四培養(yǎng)基生根培養(yǎng)基中；所述第四培養(yǎng)基構成為：基本培養(yǎng)基MS培養(yǎng)基中大量元素含量減半，減半大量元素由質量濃度，950mg/L的硝酸鉀(KNO3)，220mg/L的CaCl2·2H2O，185mg/L的MgSO4·7H2O，825mg/L的硝酸銨(NH4NO3)，85mg/L的KH2PO4·H2O組成；附加1mg/L萘乙酸(NAA)；1mg/L吲哆丁酸(IBA)和活性炭3000mg/L；蔗糖30g/L；瓊脂粉5g/L；pH6.0；培養(yǎng)室溫度為24-26℃，一個晝夜中培養(yǎng)室內光照時間為12小時，培養(yǎng)室內保持黑暗12小時，光照強度為2000-2200Lux，培養(yǎng)10天，復壯苗長出乳白色根須；
8)出瓶移栽：待步驟7)中無菌苗根長大部分為0.5-1.0cm時，將培養(yǎng)瓶移置過渡培養(yǎng)間，敞開封口膜1/3，使瓶內與室內環(huán)境一致，2天后去掉封口膜后再放置1天；采用20-22℃的水輕輕洗去組培苗根部附著的培養(yǎng)基，將其移栽到裝有新珍珠巖的苗盤中，在溫室內一層遮陽網條件下放置7天后撤去遮陽網，30天后，計算成活率，即完成高頻再生體系。
2.根據權利要求1所述的一種基于愈傷組織誘導建立馬藺高頻再生體系方法其特征是：
基本培養(yǎng)基MS中所述大量元素，由質量濃度，1900mg/L的硝酸鉀(KNO3)，440mg/L的CaCl2·2H2O，370mg/L的MgSO4·7H2O，1650mg/L的硝酸銨(NH4NO3)，170mg/L的KH2PO4·H2O組成，配制大量元素母液1L，10倍量，分別取19000mg KNO3、4400mg CaCl2·2H2O、3700mgMgSO4·7H2O、16500mg NH4NO3、1700mg KH2PO4·H2O，分別溶解后混合定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取大量元素母液100ml；微量元素由質量濃度為22.3mg/L的MnSO4·4H2O，6.2mg/L的硼酸(H3BO3)，8.6mg/L的ZnSO4·7H2O，0.25mg/L的Na2MoO4·2H2O，0.025mg/L的CuSO4·5H2O，0.025mg/L的CoCl2·6H2O，0.83mg/L的碘化鉀(KI)組成，配置微量元素母液1L，100倍量，分別取2230mg MnSO4·4H2O、620mg H3BO3，860mg ZnSO4·7H2O，25mg Na2MoO4·2H2O，2.5mg CuSO4·5H2O，2.5mg CoCl2·6H2O，83mg KI，分別溶解后混合定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取微量元素母液10ml；鐵鹽由質量濃度為27.8mg/L的FeSO4·7H2O和質量濃度為37.3mg/L的Na2·EDTA·2H2O螯合后的溶液EDTA-Fe組成，配置鐵鹽母液1L，分別取2780mgFeSO4·7H2O、3730mg Na2·EDTA·2H2O，分別加熱溶解，混合后再煮沸約20分鐘，冷卻后定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取鐵鹽溶液10ml；有機物由質量濃度為0.5mg/L的煙酸，0.5mg/L的鹽酸吡哆醇，0.4mg/L的鹽酸硫胺素，2mg/L的甘氨酸，100mg/L的肌醇組成，配置有機物母液1L，分別取50mg的煙酸，50mg的鹽酸吡哆醇，40mg的鹽酸硫胺素，200mg的甘氨酸，10000mg的肌醇，分別溶解，混合后定容至1L，每配置1L培養(yǎng)基取有機物母液10ml；蔗糖25-30g/L，瓊脂粉5g/L，pH值6，培養(yǎng)基配置成功后，分裝100mL培養(yǎng)瓶后，封上透氣膜，于120℃高溫0.1MPa壓強條件下滅菌20分鐘，取出后放于無菌操作臺備用。
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