[發明專利]高密度培養大腸桿菌細胞的方法

在審

• 申請號: 201810313598.8
• 申請日: 2013-03-12
• 公開（公告）號: CN108410788A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 許容豪;吳宜林;鄭圣燁;權世昌
• 申請（專利權）人: 韓美科學株式會社
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P21/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 王永偉;顏芳

本發明公開一種高密度培養大腸桿菌細胞的方法，其包含細胞生長步驟和表達誘導步驟，通過所述步驟可以獲得細胞質量的最大值以及伴隨的重組蛋白的最大表達。可以使用本發明的培養方法使經轉型以產生相關重組蛋白的大腸桿菌以高濃度生長。因此，所述方法增加了細胞的生產率以及所述重組蛋白的生產量，并且可以廣泛應用于有效生產重組蛋白。

本申請是分案申請，原申請的申請日為2013年3月12日，中國申請號為201380013931.9，國際申請號為PCT/KR2013/001980，發明名稱為“高密度培養大腸桿菌細胞的方法”。

技術領域

本發明涉及一種高密度培養大腸桿菌細胞的方法。更確切地說，本發明涉及一種培養大腸桿菌細胞以使其增殖增到最大的方法，其包含使大腸桿菌細胞生長和誘導重組蛋白表達以使細胞質量和重組蛋白的量增到最大的步驟。

背景技術

大腸桿菌由于其可用于大腸桿菌的培養和基因工程的高生長速率和發酵學和基因工程領域中的先進技術而成為大批量生產各種有用蛋白質最常使用的宿主細胞。高產量生產重組蛋白需要以高密度培養轉型的大腸桿菌細胞。為此目的，已開發不同類型的培養基，如復合培養基、合成培養基和半合成培養基，以及各種進給培養基的方法，如恒定速率進給、逐步增加進給速率、指數進給或特定生長速率控制、恒酸度(pH-stat)和恒溶氧(DO-stat)控制以及葡萄糖和乙酸濃度控制且用于獲得高細胞密度的大腸桿菌。但實際上，培養轉型菌株中的每一種均有特定方法和最佳條件。因此，對于高產量蛋白質生產，重要的是選擇進給培養基和培養細胞的最佳方法。

一般來說，在通過重組大腸桿菌生產重組蛋白中，對應啟動子和表達蛋白的特征影響細胞的每一單元的細胞生長速率和生產率。對于蛋白質表達通過強啟動子控制的系統，重組蛋白的快速表達可以打破宿主細胞的能量代謝平衡，進而抑制細胞生長。尤其當表達蛋白對宿主細胞具有直接負面影響時，其在較大程度上抑制宿主細胞的生長。

由于這些原因，強誘導型啟動子下的蛋白質表達變為宿主細胞的重大負擔。因此，當此負擔降到最小時，可以更容易地實現重組蛋白的大批量生產。考慮以上條件，最佳表達時間可以視表達蛋白的特征而變化，即使在使用相同類型的表達載體和宿主細胞進行蛋白質表達時也是如此。另外，表達時間對細胞生長和表達速率的影響的顯著性可以有所變化。此外，細胞生長速率和細胞質量影響蛋白質生產。在每細胞生產率相同的情況下，使用較高質量的細胞可以增加蛋白質生產的產量。因此，重要的是在通過重組微生物生產重組蛋白中建立以高密度生產細胞團塊的最佳培養條件。

由于轉型大腸桿菌的蛋白質表達與關于生長環境的各種胞內生理/生態因子(質粒復制品的穩定性和數目、轉錄和轉譯效率、表達蛋白的溶解度、蛋白分解、膜完整性等)密切相關，所以建立最佳培養條件以使生產量和生產率增到最大為至關重要的。因此，為了以高產量表達重組蛋白，需要添加適當誘導物，如IPTG，并且需要通過適當方法將具有適用于蛋白質生產的組合物的培養基進給到高密度重組大腸桿菌的培養基中。必要時，必須改進培養基組合物和進給其的方法以用于重組蛋白生產(易(Yee)和布蘭奇(Blanch),1992,生物技術(Bio/Technol.)10,1550-1556)。

在大腸桿菌中表達重組蛋白的方法可以分成三種代表性類型。第一種方法為將重組蛋白表達為大腸桿菌細胞的細胞質中的可溶形式。第二種方法為使用信號序列將重組蛋白表達到大腸桿菌細胞的胞外質。另一種方法為以包涵體(IB)形式表達蛋白質，且此方法最常用于在高產量下表達蛋白質。