[發明專利]高密度培養大腸桿菌細胞的方法在審
| 申請號： | 201810313598.8 | 申請日： | 2013-03-12 |
| 公開（公告）號： | CN108410788A | 公開（公告）日： | 2018-08-17 |
| 發明（設計）人： | 許容豪;吳宜林;鄭圣燁;權世昌 | 申請（專利權）人： | 韓美科學株式會社 |
| 主分類號： | C12N1/21 | 分類號： | C12N1/21;C12N15/70;C12P21/00;C12R1/19 |
| 代理公司： | 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245 | 代理人： | 王永偉;顏芳 |
| 地址： | 韓國*** | 國省代碼： | 韓國;KR |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 重組蛋白 大腸桿菌細胞 高密度培養 大腸桿菌 細胞 生產重組 細胞生長 伴隨的 轉型 誘導 蛋白 生長 應用 | ||
1.一種高密度培養表達免疫球蛋白Fc片段的重組大腸桿菌細胞的方法，其包括：
(i)在細胞生長培養基中以分批培養模式培養所述大腸桿菌細胞直到所述細胞生長培養基的pH增加0.1或更高；
(ii)向步驟(i)中得到的細胞培養物添加第一進料培養基，并且以恒酸度分批進料培養模式培養所述大腸桿菌細胞，直到培養物的600nm吸光度(OD600)達到120至180，其中在步驟(ii)中所述第一進料培養基在400到800rpm速度的攪拌下以200到400ml/hr的速率進給，并且進給速率和攪拌速度逐步增加；
(iii)向步驟(ii)中得到的OD600為120至180的細胞培養物添加第二進料培養基，并且以分批進料培養模式培養所述大腸桿菌細胞，其中在步驟(iii)的培養期間所述培養物的pH增加，其中在步驟(iii)中所述第二進料培養基在400到800rpm速度的攪拌下以200到400ml/hr的速率進給，并且進給速率和攪拌速度逐步減??；和
(iv)在步驟(iii)期間誘導所述免疫球蛋白Fc片段的表達，
其中所述免疫球蛋白Fc片段僅在所述細胞培養物達到150或更高的OD600值時、僅在步驟(iii)中表達；并且
其中進行步驟(iii)的培養以獲得具有200或更高的最終OD600值的細胞培養物。
2.根據權利要求1所述的方法，其中所述轉型的大腸桿菌菌株為HM11201(KCCM-10660P)。
3.根據權利要求1所述的方法，其中所述轉型的大腸桿菌菌株包含攜載Lac操縱子的表達載體。
4.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟(iv)中，所述免疫球蛋白Fc片段的所述表達通過添加異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)來誘導。
5.根據權利要求4所述的方法，其中IPTG以0.1到0.5mM的濃度添加。
6.根據權利要求4所述的方法，其中在步驟(iv)中，IPTG僅在所述細胞培養物達到150或更高的OD600值時添加。
7.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(ii)通過以3個步驟增加所述第一進料培養基的所述進給速率和所述攪拌速度進行，其中所述第一進料培養基首先在以400到600rpm的速度攪拌下以200到300mL/hr的速率，并且隨后在以500到700rpm的速度攪拌下以250到350ml/hr的進給速率，并且最后在以600到800rpm的速度攪拌下以300到400ml/hr的進給速率進給。
8.根據權利要求1所述的方法，其中步驟(iii)通過以3個步驟減小所述第一培養基的所述進給速率和所述攪拌速度進行，其中所述第一進料培養基首先在以600到800rpm的速度攪拌下以300到400mL/hr的進給速率，并且隨后在以500到700rpm的速度攪拌下以250到350ml/hr的進給速率，并且最后在以400到600rpm的速度攪拌下以200到300ml/hr的進給速率進給。
9.根據權利要求1所述的方法，其中所述細胞生長培養基由包含胰蛋白胨、酵母提取物、NaCl、KH2PO4以及(NH4)2HPO4的初始生長培養基和包含檸檬酸、FeCl2、H3BO3、MnCl2、CuCl2、Na2MoO4、CoCl2、ZnCl2以及EDTA的痕量金屬溶液組成。
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