[發明專利]一種高產L-賴氨酸的大腸桿菌重組菌及其構建方法

在審

• 申請號: 201810313577.6
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108504617A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 徐建中;張偉國
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 耿丹丹

本發明公開了一種高產L?賴氨酸的大腸桿菌重組菌及其構建方法，屬于基因工程技術領域。本發明應用基因工程方法，替換大腸桿菌LATR11中DapD編碼基因dapD為熱纖維菌中DDH編碼基因ddh_Ct，構建新的、高效的meso?DAP合成途徑并解決埃希氏屬的L?賴氨酸生產菌中異源的DDH熱穩定性不足的缺點，增強重組菌株中meso?DAP合成能力并提高菌株積累L?賴氨酸的能力。重組菌經搖瓶發酵實驗，L?賴氨酸積累量達23.1g·L^?1，最大比生成速率為0.75g·L^?1·h^?1，高于出發菌株的17.6g·L^?1和0.44g·L^?1·h^?1。此發明成功改變了大腸桿菌中meso?DAP合成途徑，解決了外源DDH熱穩定性不足的缺點，為選育L?賴氨酸高產菌株提供嶄新的思路。

技術領域

本發明涉及一種高產L-賴氨酸的大腸桿菌重組菌及其構建方法，屬于基因工程技術領域。

背景技術

L-賴氨酸屬于天冬氨酸家族氨基酸，是人類和動物所必需的、自身不能合成的八大必需氨基酸之一。由于L-賴氨酸具有多種生理功能，如平衡氨基酸組成、調節體內代謝平衡、提高機體對谷類蛋白質的吸收及利用率和促進機體生長發育等，因而被廣泛應用于飼料工業、醫藥工業及食品工業中。微生物發酵法因其具有生產成本低、生產強度高、高特異性和對環境污染小等優點，而成為當今工業生產L-賴氨酸應用最廣泛的方法。因此，選育具有自主知識產權的高L-賴氨酸合成、低副產物積累的生產菌株，實現企業可持續發展具有重要意義。

用于生產L-賴氨酸的微生物包括多種屬，如棒狀桿菌(如谷氨酸棒桿菌Corynebacterium glutamicum和鈍齒棒桿菌)及其亞種(如黃色短桿菌和乳酸發酵短桿菌)、埃希氏菌(如大腸桿菌Escherichia coli)和芽孢桿菌(如浸麻芽孢桿菌)、古生菌(如熱變形菌)以及真菌中的酵母菌(如隱球酵母)等。目前，國內外用于工業化生產L-賴氨酸的菌株多為C.glutamicum及其亞種和E.coli的改造型菌株。在C.glutamicum和E.coli中，二氨基庚二酸(DAP)途徑是其主要的L-賴氨酸生物合成途徑。DAP途徑是天冬氨酸族氨基酸合成途徑中的一部分。以天冬氨酸為底物，DAP途徑中有9個酶促反應涉及到L-賴氨酸的合成。DAP途徑存在四種不同的變化形式用于合成meso-DAP，即(A)脫氫酶途徑；(B)琥珀酰化酶途徑；(C)乙酰化酶途徑和(D)轉氨酶途徑(圖1)。通常情況下，細菌中只存在四種DAP變化途徑中的一種，如大腸桿菌只存在琥珀酰化酶途徑。然而，一些革蘭氏陽性菌，如谷氨酸棒桿菌同時存在脫氫酶途徑和琥珀酰化酶途徑。琥珀酰化酶途徑經由四步酶促反應生成meso-DAP(即四氫吡啶二羧酸琥珀酰化酶DapD、琥珀酰-氨基-吡咯酮轉氨酶DapC、琥珀酰-二氨基庚二酸脫琥珀酰酶DapE和二氨基庚二酸差向異構酶DapF)，然而脫氫酶途徑只需經過一個酶促反應就可生成meso-DAP(即二氨基庚二酸脫氫酶DDH)。