[發明專利]一種高產L-賴氨酸的大腸桿菌重組菌及其構建方法

在審

• 申請號: 201810313577.6
• 申請日: 2018-04-10
• 公開（公告）號: CN108504617A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 徐建中;張偉國
• 申請（專利權）人: 江南大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/70;C12P13/08;C12N15/53;C12R1/19
• 代理公司: 蘇州市中南偉業知識產權代理事務所(普通合伙) 32257
• 代理人: 耿丹丹

1.一種高產L-賴氨酸的大腸桿菌重組菌，其特征在于，所述重組菌異源表達了來源于嗜熱微生物的二氨基庚二酸脫氫酶。

2.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述二氨基庚二酸脫氫酶為以下任一：

(1)氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

(2)與SEQ ID NO.1所示氨基酸序列具有80％以上同源性，且具有二氨基庚二酸脫氫酶活性。

3.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述嗜熱微生物為嗜熱纖維梭菌、嗜熱球形脲芽孢桿菌或嗜熱共生桿菌。

4.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以生產L-賴氨酸的大腸桿菌為宿主。

5.根據權利要求1所述的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以pKO3-Km作為表達載體。

6.權利要求1～5任一所述重組菌的構建方法，其特征在于，所述方法具體是：

(1)重組表達載體pDXW-8/ddh_Ct的構建

將ddh_Ct片段與經相同限制性內切酶酶切后的C.glutamicum-E.coli穿梭表達質粒pDXW-8相連構建重組質粒pDXW-8/ddh_Ct；

(2)表達框Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2的獲取

以pDXW-8/ddh_Ct為模板，進行PCR，獲得Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2表達框；

(3)整合型載體pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct的構建

以E.coli LATR11基因組為模板設計引物，進行PCR，獲得分別在3’端和5’端有相同限制性內切酶的PCR產物，將以上述PCR產物分別與線性化pKO3-Km自殺型載體相連構建重組質粒pKO3-Km/ΔdapD；隨后將將純化后的PCR產物Ptac-ddh_Ct-rrnBT1T2與pKO3-Km/ΔdapD連接，獲得重組質粒pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct；

(4)重組菌株E.coli LATR11ΔdapD::ddh_Ct的構建

將質粒pKO3-Km/ΔdapD::ddh_Ct電擊轉化E.coli LATR11，篩選得到重組菌E.coliLATR11ΔdapD::ddh_Ct。

7.權利要求1～5任一所述重組菌發酵生產L-賴氨酸的方法，其特征在于，所述方法是將所述重組菌單菌落接種至液體種子培養基，35-38℃，80-120r·min^-1培養10-14h；以5-15％接種量將種子培養液轉接至發酵培養基，35-38℃，80-120r·min^-1培養30-50h。

8.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述種子培養基為：葡萄糖15-25g·L^-1，玉米漿5-15g·L^-1，(NH₄)₂SO₄5-15g·L^-1，KH₂PO₄1-2g·L^-1，MgSO₄·7H₂O 0.5-1.5g·L^-1，FeSO₄·7H₂O 0.05-0.15g·L^-1，MnSO₄·4H₂O 0.05-0.15g·L^-1，L-蘇氨酸0.5-1.5g·L^-1，生物素0.0004-0.0008g·L^-1，CaCO₃15-25g·L^-1。