[發(fā)明專利]一種釀酒酵母菌、其構(gòu)建方法及其在發(fā)酵制備番茄紅素中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810311320.7
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108373980B
• 公開（公告）日: 2019-12-03
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張根林;李霞;趙金雨
• 申請（專利權(quán)）人: 石河子大學(xué)
• 主分類號: C12N1/19
• 分類號: C12N1/19;C12P5/02;C12R1/865
• 代理公司: 11700 北京智客聯(lián)合知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙)
• 代理人: 李戍<國際申請>=<國際公布>=<進(jìn)入國

本發(fā)明公開了一種釀酒酵母工程菌的構(gòu)建方法及其在發(fā)酵制備番茄紅素中的應(yīng)用。本發(fā)明的有益效果為：1、本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌，是將多個(gè)基因表達(dá)盒通過酵母強(qiáng)大的同源重組系統(tǒng)重組至酵母基因組的不同位點(diǎn)，表達(dá)遺傳更穩(wěn)定；2、本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌為生產(chǎn)番茄紅素提供優(yōu)化的宿主細(xì)胞，并且此菌株強(qiáng)化了類異戊二烯合成途徑代謝通量,可以作為生產(chǎn)別的萜類化合物的底盤宿主；3、本發(fā)明構(gòu)建的釀酒酵母工程菌合成番茄紅素途徑受組成型啟動(dòng)子控制，發(fā)酵過程無需添加誘導(dǎo)劑，節(jié)約了發(fā)酵成本，且發(fā)酵操作更加簡單。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種釀酒酵母菌、其構(gòu)建方法及其在發(fā)酵制備番茄紅素中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

番茄紅素(Lycopene)是一種抗氧化活性很強(qiáng)的萜類物質(zhì)，具有猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化等多種生理功能活性，在癌癥預(yù)防，抗衰老，保護(hù)心腦血管和增強(qiáng)機(jī)體免疫力等方面有廣泛應(yīng)用，被世界衛(wèi)生組織(WHO)和聯(lián)合國糧農(nóng)組織(FAO)認(rèn)定為A類營養(yǎng)素，市場前景較好。目前生產(chǎn)番茄紅素常用的方法有直接提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。由于原料番茄的供應(yīng)受到氣候與季節(jié)的影響，使得直接提取法生產(chǎn)成本較高。化學(xué)合成法一般以β-紫羅酮為原料，合成過程步驟繁瑣，且化學(xué)試劑殘留問題限制了產(chǎn)品的使用范圍。而微生物發(fā)酵法由于不受氣候和季節(jié)影響、生產(chǎn)周期短、易于大規(guī)模培養(yǎng)等優(yōu)勢逐漸受到人們的關(guān)注。釀酒酵母具有遺傳可操作性以及成熟的大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)使其在食品工業(yè)中被廣泛應(yīng)用。作為安全的模式微生物，釀酒酵母存在能合成萜類的甲羥戊酸(MVA)途徑，已經(jīng)作為生產(chǎn)青蒿酸、香紫蘇醇、β-香樹脂醇、人參皂苷等天然產(chǎn)物的優(yōu)良宿主使用。通過強(qiáng)化釀酒酵母MVA合成途徑增加前體物供應(yīng)和引入番茄紅素合成的相關(guān)基因經(jīng)模塊化設(shè)計(jì)整合至酵母基因組上實(shí)現(xiàn)釀酒酵母生產(chǎn)番茄紅素，將為釀酒酵母高效合成萜類物質(zhì)提供技術(shù)支持。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的就是針對上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，即番茄紅素在植物中積累量低和化學(xué)合成困難的局限，提供了一種釀酒酵母菌、其構(gòu)建方法及其在發(fā)酵制備番茄紅素中的應(yīng)用。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案為：提供了一株含有完整番茄紅素生物合成途徑的釀酒酵母菌，所述釀酒酵母菌命名為釀酒酵母W2(Saccharomycescerevisiae W2)，保藏單位為中國典型培養(yǎng)物保藏中心(武漢大學(xué)，武漢市武昌珞珈山郵編：430072)，保藏時(shí)間為2018年03月13日，保藏編號為CCTCC NO：M 2018123。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供了上述釀酒酵母菌W2的構(gòu)建方法，是將來源于釀酒酵母CEN.PK2-1C的甲羥戊酸途徑的相關(guān)基因ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8和ERG19分別構(gòu)建形成基因表達(dá)盒，然后運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化基因表達(dá)盒于釀酒酵母CEN.PK2-1C中，利用酵母同源重組能力組裝形成強(qiáng)化了釀酒酵母類異戊二烯合成途徑代謝通量的釀酒酵母工程菌w1；之后將來源于大腸桿菌的IDI1、嗜酸熱硫化葉菌的SaGGPS、歐文氏菌的CrtB和紅法夫酵母的CrtI分別構(gòu)建形成基因表達(dá)盒，然后運(yùn)用醋酸鋰轉(zhuǎn)化法共轉(zhuǎn)化基因表達(dá)盒于釀酒酵母工程菌W1中，利用酵母同源重組能力組裝形成含有完整番茄紅素生物合成途徑的釀酒酵母菌W2。

進(jìn)一步的，上述的一種釀酒酵母菌W2的構(gòu)建方法，所述釀酒酵母工程菌W1提供的基因表達(dá)盒的構(gòu)建方法，是利用組成型啟動(dòng)子ADH1p、ALA1p、FBA1p、TDH3p、TYS1p、GPM1p和終止子SDH2t、ILV1t、VPS8t、PIM15t、REI1t、LRP1t控制ERG10、ERG13、tHMG1、ERG12、ERG8和ERG19基因的表達(dá)。

進(jìn)一步的，上述的一種釀酒酵母菌W2的構(gòu)建方法，所述釀酒酵母菌W2提供的基因表達(dá)盒的構(gòu)建方法，是利用組成型啟動(dòng)子ALA1p、ADH1p、TEF1p、FBA1p和終止子RIM15t、HOG1t、CYC1t、TYS1t控制IDI1、SaGGPS、CrtB和CrtI基因的表達(dá)。