[發明專利]雙熒光標記實現油菜種子單細胞及油滴三維可視化的方法

有效

• 申請號: 201810311109.5
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108872166B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 栗茂騰;尹永泰;郭禎怡;陳康;郭亮星;張凱
• 申請（專利權）人: 華中科技大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 華中科技大學專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒;李智

1. 一種利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)油菜種子的解剖及切片

選取油菜種子在解剖鏡下去除種皮并保留種子胚胎；將剝離的種子胚胎分解為外子葉、內子葉及胚軸；將外子葉、內子葉及胚軸切成0.5-2 mm厚的切片；

(2)油菜種子切片的尼羅紅染色及DiO染色，使細胞膜染料DiO特異性地對細胞膜染色，尼羅紅染料只針對油滴染色，具體的：

將所述步驟(1)得到的種子胚胎切片先在尼羅紅染色液中染色5-10 min，染色完畢用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3-5次；所述尼羅紅染色液為磷酸鹽緩沖液與尼羅紅的混合液；接著，再將該種子胚胎切片在DiO染色液中染色5-15 min，染色完畢用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3-5次；所述DiO染色液為磷酸鹽緩沖液與DiO的混合液；

或者，將所述步驟(1)得到的種子胚胎切片先在DiO染色液中染色5-15 min，染色完畢用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3-5次；所述DiO染色液為磷酸鹽緩沖液與DiO的混合液；接著，再將該種子胚胎切片在尼羅紅染色液中染色5-10 min，染色完畢用0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液漂洗3-5次；所述尼羅紅染色液為磷酸鹽緩沖液與尼羅紅的混合液；

(3)油菜種子雙熒光標記切片標本制作

將所述步驟(2)得到的完成了雙熒光染色的種子切片置于載玻片與蓋玻片之間，由此制作切片標本；

(4)激光共聚焦顯微鏡雙熒光深層掃描

將所述步驟(3)得到的所述切片標本放到激光共聚焦顯微鏡下，然后打開559 nm激發通道和488 nm激發通道，發射波長分別為570-670 nm和510-550 nm；對一層細胞從一側到另一側進行深度掃描，掃描完成后，將掃描得到的所有圖像進行保存；

(5)油菜種子細胞雙熒光標記信號的三維重構

使用三維重構軟件分別對488 nm 和559 nm光激發通道得到的圖像進行逐張信號分割并重構，由此得到所述油菜種子細胞及該油菜種子細胞內油滴的三維立體圖像，并進一步基于積分原理計算得出所述油菜種子細胞及該油菜種子細胞內油滴的體積。

2.如權利要求1所述利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述尼羅紅染色液中的磷酸鹽緩沖液為pH為7.0-7.4的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液，該尼羅紅染色液中尼羅紅的濃度為1 mg/L；染色時間為10 min。

3.如權利要求2所述利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，所述尼羅紅染色液中的磷酸鹽緩沖液為pH為7.2的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。

4.如權利要求1所述利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，所述步驟(2)中，所述DiO染色液中的磷酸鹽緩沖液為pH為7.0-7.4的0.2mol/L磷酸鹽緩沖液，該DiO染色液中DiO的濃度為5 μmol/L；染色時間為10 min。

5.如權利要求4所述利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，所述DiO染色液中的磷酸鹽緩沖液為pH為7.2的0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液。

6.如權利要求1所述利用雙熒光標記實現油菜種子細胞及其內油滴的體積計算的方法，其特征在于，所述步驟(4)具體是將所述步驟(3)得到的所述切片標本放到激光共聚焦顯微鏡下，使用100倍物鏡，數值孔徑為1.4，在鏡頭和玻片之間滴加一滴松柏油，打開559nm激發通道和488 nm激發通道，發射波長分別為570-670 nm和510-550 nm；對一層細胞從一側到另一側進行深度掃描，掃描步長0.38 nm；掃描完成后，將掃描得到的所有圖像保存為tiff格式。