[發(fā)明專利]雙熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)油菜種子單細(xì)胞及油滴三維可視化的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810311109.5
• 申請(qǐng)日: 2018-04-09
• 公開（公告）號(hào): CN108872166B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 栗茂騰;尹永泰;郭禎怡;陳康;郭亮星;張凱
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中科技大學(xué)
• 主分類號(hào): G01N21/64
• 分類號(hào): G01N21/64
• 代理公司: 華中科技大學(xué)專利中心 42201
• 代理人: 許恒恒;李智

本發(fā)明公開了一種雙熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)油菜種子單細(xì)胞及油滴三維可視化的方法，該方法包括以下步驟：(1)油菜種子的解剖及切片；(2)油菜種子切片的尼羅紅染色及DiO染色；(3)油菜種子雙熒光標(biāo)記切片標(biāo)本制作；(4)激光共聚焦顯微鏡雙熒光深層掃描；(5)油菜種子細(xì)胞雙熒光標(biāo)記信號(hào)的三維重構(gòu)。本發(fā)明利用雙熒光標(biāo)記，并具體通過對(duì)染料的具體種類及具體染色過程、后續(xù)激光共聚焦深層掃描所采用的掃描條件等進(jìn)行改進(jìn)及進(jìn)一步優(yōu)選，與現(xiàn)有技術(shù)相比能夠有效解決油菜種子細(xì)胞或該油菜種子細(xì)胞內(nèi)油滴其三維可視化處理難等問題，并且能夠?qū)崿F(xiàn)油滴和細(xì)胞體積的精準(zhǔn)測量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物組織成像技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種雙熒光標(biāo)記實(shí)現(xiàn)油菜種子單細(xì)胞及油滴三維可視化的方法，該方法通過共聚焦顯微鏡斷層掃描技術(shù)和三維重構(gòu)技術(shù)聯(lián)用，利用雙熒光標(biāo)記能夠?qū)崿F(xiàn)油菜種子內(nèi)的油滴和細(xì)胞整體三維可視化處理和相應(yīng)體積的計(jì)算。

背景技術(shù)

油菜是產(chǎn)油效率最高的油料作物之一，菜籽油是中國傳統(tǒng)的食用油，是國產(chǎn)食用植物油的第一大來源，在我國食用油市場中具有舉足輕重的地位。在此背景下，我國油菜科技工作者正在引領(lǐng)和推動(dòng)以高油、高產(chǎn)、高效為目標(biāo)的油菜生產(chǎn)的技術(shù)飛躍。在提高油菜含油量的研究中不可避免的需要掌握油菜種子內(nèi)的油脂積累規(guī)律，包括油菜種子中油脂在細(xì)胞和組織內(nèi)的空間分布，油滴大小和數(shù)目，油滴密度等一系列形態(tài)規(guī)律。

目前，觀察油菜種子內(nèi)部油脂形態(tài)的主要方法有普通光學(xué)顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡和電子透射顯微鏡等方法。付麗霞等(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).(1993)12(6):556-560.)，韋存虛等.(中國油料作物學(xué)報(bào)(2009)31(4):445-448)，Zhi-Yong Hu等.(PLoS ONE(2013)8(4):e62099)利用透射電鏡技術(shù)觀察了油菜種子中油體大小、數(shù)目、形態(tài)等指標(biāo)。董勁松等(植物學(xué)報(bào).(2009),44(1):79-85)利用激光共聚焦顯微鏡觀察了油菜高低油種子中油體數(shù)目、形態(tài)、分布特征，得到了油菜種子細(xì)胞中油體的數(shù)量和總面積與含油量之間存在正相關(guān)的結(jié)論。Jianwei Gu等(Front.PlantSci.(2017),7:1989)對(duì)高低油甘藍(lán)型油菜種子進(jìn)行透射電鏡觀察并應(yīng)用image J軟件對(duì)油體面積進(jìn)行大量統(tǒng)計(jì)，得到了油體大小與含油量之間的規(guī)律關(guān)系。上述研究均在二維水平對(duì)油體大小形態(tài)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。油滴在種子內(nèi)部是以近似球體或橢球體形式存在的，因此，通過切片結(jié)合二維水平的顯微觀察容易出現(xiàn)大小或形態(tài)的偏差。近年來三維成像技術(shù)在組織、細(xì)胞成像領(lǐng)域的應(yīng)用越來越多。Martine Miquel等.(Plant Physiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)擬南芥種子內(nèi)油滴進(jìn)行深度斷層掃描得到了油滴的三維立體圖像，這是首次對(duì)含油種子內(nèi)的油滴進(jìn)行三維水平的可視化報(bào)道。但在細(xì)胞含油量計(jì)算方面，該現(xiàn)有技術(shù)僅能定性的判定細(xì)胞內(nèi)的油滴大小，無法定量得出油滴的具體體積、以及油滴體積占細(xì)胞體積的占比。

長期以來，對(duì)油菜種子的含油量的定量解析主要在宏觀水平，例如，索氏提取法測定種子總的含油量，這一測定技術(shù)對(duì)于衡量一個(gè)油菜品種的含油量是準(zhǔn)確可行且廣為接受。然而，隨著研究的深入和精細(xì)化的研究需求，如何探索單細(xì)胞含油量或局部組織細(xì)胞含油量的變化規(guī)律，則成為未來的研究方向之一。在測定單細(xì)胞含油量或局部組織細(xì)胞含油量的研究中，目前沒有有效的研究手段，也就是說，目前無法對(duì)單細(xì)胞含油量或局部組織細(xì)胞含油量進(jìn)行測定，尤其是定量測定。現(xiàn)有技術(shù)中所采用的透射電鏡、普通光學(xué)顯微鏡及共聚焦顯微鏡等技術(shù)，目前主要在二維、單張切片的層面上進(jìn)行觀察而無法對(duì)單細(xì)胞含油量或局部組織細(xì)胞含油量進(jìn)行定量測定。因此，在單細(xì)胞含油量或局部組織細(xì)胞含油量測定方面存在技術(shù)空白。

以現(xiàn)有技術(shù)中Martine Miquel等.(Plant Physiology(2014)164:1866-1878)使用激光共聚焦顯微鏡對(duì)擬南芥種子內(nèi)油滴進(jìn)行深度斷層掃描得到了油滴的三維立體圖像為例，這是首次對(duì)含油種子內(nèi)的油滴進(jìn)行三維水平的可視化報(bào)道。但該技術(shù)仍無法對(duì)單細(xì)胞的含油量進(jìn)行定量測定。Martine Miquel等的研究能夠觀察油滴融合過程，即，小油滴隨著種子發(fā)育逐漸融合成一定大小的大油滴，能夠得到定性的觀察結(jié)果，但對(duì)細(xì)胞內(nèi)的含油量仍無法進(jìn)行測定。