[發明專利]一種克隆未知基因的方法及其應用

在審

• 申請號: 201810310448.1
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108866040A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 李聯泰;安賢惠;楊喬喬;顧金付;陸紅艷
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;G01N33/68;G06F19/18
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

本發明公開了一種克隆未知基因的方法及其應用，包括如下步驟：S1：蛋白質序列測定及數據分析；S2：將上述蛋白電泳所得的蛋白條帶取樣，將取樣的蛋白條放入檢測設備中進行二級質譜分析；S3：預測蛋白質序列數據匯總整理。本發明確保了產品性能的穩定，提高了效率，穩定性高，降低了生產和應用的成本，促進了益生菌的大面積推廣使用，通過獲知控制拮抗菌拮抗活性成分的基因，并通過分子生物學手段對該基因進行克隆，獲得工程菌株，進而通過發酵工程技術批量生產該菌株，對該基因進行高通量表達，最終為生產提供穩定、高產、高效的微生物制劑。

技術領域

本發明涉及克隆未知基因技術領域，具體為一種克隆未知基因的方法及其應用。

背景技術

基因工程的上游工程主要是目的基因的制取和無性繁殖。具體地說是從生物體的組織、器官或細胞制取目的基因或者人工合成目的基因，將目的基因與載體的DNA拼接，使重組體分子導入受體細胞，篩選和進行無性繁殖。這個過程可以稱為基因克隆。基因克隆是70年代發展起來的一項具有革命性的研究技術，可概括為∶分、切、連、轉、選。最終目的在于通過相應技術手段，將目的基因導入寄主細胞，在宿主細胞內目的基因被大量的復制。基因是細胞內DNA分子上具有遺傳效應的特定核苷酸序列的總稱，是具有遺傳效應的DNA分子片段。基因控制蛋白質合成，是不同物種以及同一物種的不同個體表現出不同的性狀的根本原因，即所謂種瓜得瓜，種豆得豆，一母生九子，九子各不同。基因通過DNA復制及細胞分裂把遺傳信息傳遞給下一代，并通過控制蛋白質的合成使遺傳信息得到表達。

目前生產上已有不少益生菌在示范推廣中，但顯現出的突出問題一是產品性能不穩定，二是有效成分比例偏低，三是生產和應用成本較高，嚴重限制了益生菌的大面積推廣使用。

發明內容

(一)解決的技術問題

針對現有技術的不足，本發明提供了一種克隆未知基因的方法及其應用，解決了上述背景技術中所提出的問題。

(二)技術方案

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種克隆未知基因的方法，包括如下步驟：

S1：蛋白質序列測定及數據分析；

S2：將上述蛋白電泳所得的蛋白條帶取樣，將取樣的蛋白條放入檢測設備中進行二級質譜分析；

S3：預測蛋白質序列數據匯總整理：

①根據測序反饋回來的蛋白質信息，進行分析，首先將不同數據庫中的蛋白質分別整理，每個數據庫中每個樣品的，每種蛋白質名稱、分子量大小等電點、肽段數和序列號等各種原始數據分類歸納到一起。

②將所有數據庫的數據放在一起整理，將相同蛋白質的整理在一起，比較相同蛋白質的菌株來源和分子量以及肽段數等的區別。

③將相同的蛋白質歸為一組，整理蛋白質與菌株。

S4：預測蛋白的分組及氨基酸序列數據庫的建立：

根據上述整理出來的預測蛋白質的數據，通過每種蛋白不同菌株來源的序列號進入相應的數據庫中進行氨基酸序列的搜索查詢，并下載每種蛋白質的氨基酸信息，保存在單獨的文本文檔并命名以建立個人蛋白質數據庫。

S5：引物設計：

1)用Vector NTI Advance 11軟件對氨基酸序列進行比對，將同源性較高的歸為一組。

2)根據每組蛋白N端和C端的同源性，各取7個氨基酸序列，查對遺傳密碼子表，將氨基酸序列轉化為對應的核酸序列，以基因頭尾固定的方式手動設計引物，同時考慮氨基酸的兼并性、酶切位點及其保護堿基。

3)引物合成。