[發明專利]一種克隆未知基因的方法及其應用

在審

• 申請號: 201810310448.1
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108866040A
• 公開（公告）日: 2018-11-23
• 發明（設計）人: 李聯泰;安賢惠;楊喬喬;顧金付;陸紅艷
• 申請（專利權）人: 淮海工學院
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C12N15/70;G01N33/68;G06F19/18
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種克隆未知基因的方法，其特征在于：包括如下步驟：

S1：蛋白質序列測定及數據分析；

S2：將上述蛋白電泳所得的蛋白條帶取樣，將取樣的蛋白條放入檢測設備中進行二級質譜分析；

S3：預測蛋白質序列數據匯總整理：

①根據測序反饋回來的蛋白質信息，進行分析，首先將不同數據庫中的蛋白質分別整理，每個數據庫中每個樣品的，每種蛋白質名稱、分子量大小等電點、肽段數和序列號等各種原始數據分類歸納到一起。

②將所有數據庫的數據放在一起整理，將相同蛋白質的整理在一起，比較相同蛋白質的菌株來源和分子量以及肽段數等的區別。

③將相同的蛋白質歸為一組，整理蛋白質與菌株。

S4：預測蛋白的分組及氨基酸序列數據庫的建立：

根據上述整理出來的預測蛋白質的數據，通過每種蛋白不同菌株來源的序列號進入相應的數據庫中進行氨基酸序列的搜索查詢，并下載每種蛋白質的氨基酸信息，保存在單獨的文本文檔并命名以建立個人蛋白質數據庫。

S5：引物設計：

1)用Vector NTI Advance 11軟件對氨基酸序列進行比對，將同源性較高的歸為一組。

2)根據每組蛋白N端和C端的同源性，各取7個氨基酸序列，查對遺傳密碼子表，將氨基酸序列轉化為對應的核酸序列，以基因頭尾固定的方式手動設計引物，同時考慮氨基酸的兼并性、酶切位點及其保護堿基。

3)引物合成。

S6：目的基因擴增及測序：以研究菌株總DNA為模板，以下列反應程序和體系擴增目的基因(目的基因被命名為an04)，進而T-克隆。

PCR反應程序：

PCR體系：

S7：目的基因擴增

(1)酶連PCR產物按Takara T4 DNA Ligase使用說明書操作，將目的基因與T-載體連接。

(2)轉化常規化學轉化法轉化E.coli Top10。

(3)測序。

S8：目的基因克?。簩⒛康幕蚺c表達載體pET15b連接，用常規化學轉化法轉入表達宿主E.coli BL21(DE3)plysS。

S9：目的基因的誘導及抑菌活性檢測：三區劃線E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-目的基因，挑取單菌落接種到5mL LB液體培養基中，通過37℃搖床培養，室內放置10h，放置10h后按照1:100的比例轉接到1000mL LB培養基中進行擴大培養至A600到0.8～1.0，隨后加入0.16mM IPTG(0.8M IPTG 200μL/L)，并在25℃下誘導10h。

抑菌活性檢測：以哈維氏弧菌為指示菌，檢測克隆基因表達產物的拮抗性能，采用打孔法，具體操作如下：用移液槍吸取1μL過夜培養的哈維氏弧菌發酵液，加入99μL無菌水，稀釋為1％，均勻涂布到LB平板上，用無菌黃色槍頭大頭在培養基上打孔，孔中添加50μL拮抗菌，至拮抗菌完全滲入培養基后28℃培養，9h后觀察抑菌活性。

S10：克隆基因誘導表達產物分子量分析，常規蛋白電泳技術，檢測方法7誘導表達產物的分子量。

S11：得出結論：

1、抗菌肽電泳：可抑制哈維氏弧菌生長的拮抗菌

BACILLUS PUMILUS E14-3，其發酵液經硫酸銨沉淀、DEAE離子交換分離，具有拮抗作用的成分經蛋白電泳。分子量在25kD以下，和前期研究中質譜分析結果21kD一致。

2、蛋白質測序及數據分析，將條帶取樣，條帶標注為1，2，3，進行二級質譜分析，預測蛋白質組成及氨基酸序列，根據預測蛋白序列結果，留取蛋白質可信度在85％以上的蛋白質并歸類，35個菌株8種不同類型的蛋白質，將來自不同菌株、分子量在21kD左右的蛋白

Phosphoheptose isomerase，在相應數據庫中下載對應蛋白質的氨基酸序列信息，由此獲得Phosphoheptose isomerase N端和C端氨基酸序列分別為MYHDLIR和EKEMVKA。

3、引物設計通過預測蛋白質Phosphoheptose isomerase的首尾氨基酸序列，設計引物，命名為SW-06F &SW-06R，其序列如下：SW-06F GCTCTAGAATGTAYCATGAYCTNATHCGN SW-06R CGGGATCCRGCYTTRACCATYTCYTTYTC4、目的基因擴增以哈維氏弧菌拮抗菌株BACILLUSPUMILUS E14-3總DNA為模板，按方法4進行PCR擴增并與及T-載體連接：

GCTCTAGAATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCGGATCCCGA5、目的基因克隆根據T-測序結果，兩端添加酶切位點Nde I/BamHI，連入pET15b，轉化E.coli Top10，得E.coliTop10/pET15b-an04，目的基因序列如下：

CATATGTATCATGATCTCATACGTAGTGAACTGAACGAAGCGGCCGATACCCTGGCGAAATTTATCAATGACGATGCCAATATCGACGCCATTCAACGCGCGGCAGTGCTGCTGGCCGACTCCTTCAAAGCCGGCGGGAAAGTCATTTCCTGCGGTAACGGTGGCTCCCACTGTGACGCCATGCATTTTGCCGAAGAGCTGACCGGCCGCTACCGTGAAAACCGCCCAGGCTATCCGGCGATTGCCATTTCCGACGTTAGCCACCTGTCTTGCGTCAGCAACGACTTCGGCTACGAGTATGTGTTTTCGCGCTATGTGGAAGCGGTAGGCCGCGAAGGCGACGTACTGCTGGGCATTTCCACCTCAGGCAACTCCGGCAACATCATTAAAGCTATCGAAGCGGCGCGTGCCAAAGGGATGAAAGTGATCACCCTGACCGGCAAAGACGGCGGCAAAATGGCCGGTTCCGCAGACGTGGAAATCCGCGTACCGCACTTCGGTTACGCCGATCGCATCCAGGAAATTCATATCAAAGCGATCCACATCTTGATTCAGCTGATCGAGAAAGAGATGGTCAAAGCCTAAGGATCC6、目的基因轉化表達宿主從E.coli Top10/pET15b-an04中提取質粒pET15b-an04，化學法轉化表達宿主E.coliBL21(DE3)plysS，得E.coli BL21(DE3)plysS/pET15b-an04，該菌株命名為An04。目的基因的誘導表達及抑菌活性檢測誘導：將An04三區劃線，C過夜培養，隨機挑取5個單菌落，誘導表達目的基因，表達產物用于抑菌活性檢測，抑菌活性檢測。成功克隆到了拮抗哈維氏弧菌生長的基因。克隆基因誘導表達產物分子量分析，將上述經誘導表達的基因產物，進行SDS-PAGE電泳檢測，結果該基因被成功誘導表達，且誘導表達產物分子量在20.1kD處，與Bacillus pumilus E14-3拮抗菌株活性成分分子量為21kD一致。