[發(fā)明專利]誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法及其在性功能恢復(fù)中的應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810309042.1
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108588004A
• 公開（公告）日: 2018-09-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋蕓娟;胡士庶;張治國
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市萊利賽生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;A61K35/52;A61P5/26
• 代理公司: 北京棧橋知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11670
• 代理人: 潘衛(wèi)鋒

1.一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟:

(1)間充質(zhì)干細胞的培養(yǎng):將間充質(zhì)干細胞單體按4-6×10⁵/ml接種于干細胞培養(yǎng)液中，并置于38℃的培養(yǎng)箱內(nèi)，以1℃/天的速度降至36℃，后一直恒溫保持在36℃，之后每2-3天換液傳代一次，收獲4-6代間充質(zhì)干細胞，然后用體積比為2:1.5的0.3％膠原酶和0.25％胰蛋白酶先后加入進行消化25-40min，再通過振蕩器震蕩10-12min，得到培養(yǎng)擴增的間充質(zhì)干細胞；其中干細胞培養(yǎng)液為DMEM和F12按體積比1.5:1混合后并加入3％FBS作為基礎(chǔ)培養(yǎng)液，還含有55ng/ml EGF、15ng/ml bFGF、3％非必需氨基酸、0.3mM GABA、1.5％復(fù)合維生素，余量為超純水；

(2)誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞:將步驟(1)得到的間充質(zhì)干細胞按照4-6×10⁴/ml的細胞密度貼壁在二氧化鈦納米管容器上誘導(dǎo)培養(yǎng)，貼壁培養(yǎng)2天后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進行培養(yǎng)，3-4天后半量換液，5-6天時終止誘導(dǎo)；其中誘導(dǎo)培養(yǎng)液為DMEM作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，還含有8％FBS、80U/ml青霉素、60μg/ml青鏈霉素、35μg/ml微量元素化合物、25μg/ml谷氨酰胺、150uM二丁酰環(huán)磷腺苷、17μg/ml丙氨酰谷氨酰胺、15ng/ml EGF和4ng/ml LH，余量為超純水。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述復(fù)合維生素為維生素A、維生素B2、維生素C、維生素E、維生素H以質(zhì)量比為1:1.5:0.8:2:1組成的。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述微量元素化合物為硫酸鋅、氯化鐵、氯化鉀、碘酸鉀以質(zhì)量比為2:1.5:1:0.9組成的。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞的制備方法中采用的酶液為體積比3:2的0.25％胰蛋白酶與0.2％膠原酶混合的混合酶液。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述間充質(zhì)干細胞的制備方法包括以下步驟:

(1)抽取用藥患者脂肪組織15ml，利用清洗液沖洗后，將脂肪組織破碎至直徑2-3mm的脂肪粒塊，再利用清洗液清洗2-3次；

(2)在所述脂肪粒塊中加入體積比3:2的0.25％胰蛋白酶與0.2％膠原酶的混合酶液，并不斷以50-60rpm的速度進行攪拌，在恒溫37℃下消化50-70min；

(3)消化處理后，再經(jīng)過230目篩后利用離心機以800-1300rpm離心3-5min，吸出下層細胞液移至間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)后得到間充質(zhì)干細胞；

(4)將制備的間充質(zhì)干細胞凍存于-196℃的深低溫中，以便后續(xù)使用。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種誘導(dǎo)分化睪丸間質(zhì)細胞的方法，其特征在于，所述步驟(3)中放置于間充質(zhì)細胞培養(yǎng)液中培養(yǎng)，是指待組織塊周圍有梭型細胞爬出后，培養(yǎng)至80-90％細胞融合。

7.一種睪丸間質(zhì)細胞在性功能恢復(fù)中的應(yīng)用，其特征在于，將所述睪丸間質(zhì)細胞制備成性功能恢復(fù)藥物。

8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述性功能恢復(fù)藥物按照重量百分比計包括:10-13％睪丸間質(zhì)細胞、7-9％人血白蛋白原液、1.6-2.3％葡萄糖酸鋅、2.1-3.6％類黃酮素、0.4-0.6％亭扎肝素鈉、3-7％熟地黃濃縮液、4-5％維生素E、0.2-0.3％硫辛酸、3.7-5.8％LH、1.3-1.7％谷氨酰胺、0.3-0.7％乳化劑、1-2％穩(wěn)定劑、0.6-0.7％pH調(diào)節(jié)劑，余量為生理鹽水。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述性功能恢復(fù)藥物的制備方法包括以下步驟:

(1)將睪丸間質(zhì)細胞用所述人血白蛋白原液進行稀釋，在37℃恒溫下，以100rpm的轉(zhuǎn)速緩緩攪拌10-15min，得到稀釋細胞溶液；

(2)將所述熟地黃濃縮液、葡萄糖酸鋅、亭扎肝素鈉依次用40％、30％、30％的所述生理鹽水進行溶解，在通過超聲波分散3-5min后，分別得到熟地黃溶液、葡萄糖酸鋅溶液、亭扎肝素鈉溶液，將所述三種溶液混合，加熱至55℃攪拌3-5分鐘，靜置冷卻至室溫，形成混合溶液；

(3)將所述混合溶液與所述稀釋細胞溶液進行混合，以150rpm的速度進行攪拌5-7min，得到混合細胞溶液，混合期間溶液溫度恒溫37℃；

(4)再將類黃酮素、維生素E、硫辛酸混合后加入所述混合細胞溶液中，在37℃恒溫下通過超聲波分散輔助混合，經(jīng)過20-25min后，再加入LH和谷氨酰胺以100rpm的速度進行攪拌2-3分鐘，得到藥物混合溶液；

(5)在所述藥物混合溶液中加入乳化劑、穩(wěn)定劑，以120rpm速度攪拌5-10min，期間通過加入所述pH調(diào)節(jié)劑至藥物混合溶液pH＝7.1-7.3，即得到睪丸間質(zhì)細胞制成性功能恢復(fù)藥物的注射液。