[發明專利]一種能夠識別雞新城疫病毒的表位抗體的制備方法

在審

• 申請號: 201810308428.0
• 申請日: 2018-04-09
• 公開（公告）號: CN108546296A
• 公開（公告）日: 2018-09-18
• 發明（設計）人: 王選年;馮春花;李鵬;孫國鵬;王利平;岳鋒;朱艷平;張艷芳;張萬方;武樂祎;任鵬舉;王亞平;王玲玲
• 申請（專利權）人: 新鄉學院
• 主分類號: C07K16/10
• 分類號: C07K16/10;C07K16/06;C07K1/22
• 代理公司: 新鄉市平原智匯知識產權代理事務所(普通合伙) 41139
• 代理人: 路寬

本發明公開了一種能夠識別雞新城疫病毒的表位抗體的制備方法，屬于表位抗體的制備技術領域。本發明的技術方案要點為：根據篩選到的NDV病毒一條能夠識別NDV抗體的多肽P25，再根據該多肽P25篩選出針對多肽P25的表位抗體，該多肽P25表位抗體能夠與新城疫病毒發生特異性反應，縮短了制備NDV多肽P25表位抗體的過程。

技術領域

本發明屬于表位抗體的制備技術領域，具體涉及一種能夠識別雞新城疫病毒的表位抗體的制備方法。

背景技術

新城疫(Newcastle Disease)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)引起的一種急性、熱性、敗血性和高觸性禽類傳染病，其發病率與死亡率都很高，嚴重危害著我國養禽業的發展。新城疫病毒屬于副黏病毒科(Paramyxoviridae)、禽腮腺炎病毒屬，單股負鏈RNA病毒，有囊膜，其基因組全長為15186bp，編碼6個結構蛋白，包括磷蛋白(P)、核蛋白(NP)、基質蛋白(M)、融合蛋白(F)、大蛋白(L)以及血凝素-神經氨酸蛋白(HN) 六種蛋白。血凝素-神經氨酸酶蛋白(HN)具有血凝素活性(HA)及神經酸氨酶活性(NA) 并能協同F蛋白發揮作用，在病毒感染過程中，HN蛋白特異性地識別宿主細胞表面唾液酸受體，這是病毒感染宿主細胞所必需的，并且能夠誘導機體產生保護性免疫抗體。

目前，常用的檢測方法有血凝素反應(hemagglutinin，HA)、血凝抑制反應(hemagglutinin inhibition，HI)、酶聯免疫吸附試驗法(enzyme-linked immunosorbentassay，ELISA)和實時定量PCR等檢測方法，然而這些方法都比較耗時費力，需要實驗室特殊的設備才能檢測，并且不能及時地對雞新城疫病毒的流行傳播做出診斷。現有的NDV免疫膠體金檢測方法是通過小鼠骨髓瘤細胞制備NDV單克隆抗體，然后標記膠體金制備NDV快速檢測試紙條，此方法需要制備純化的抗原，免疫小鼠，飼養動物細胞等繁瑣的過程。

發明內容

本發明解決的技術問題是提供了一種能夠識別雞新城疫病毒的表位抗體的制備方法，該方法是根據篩選到的NDV病毒一條能夠識別NDV抗體的多肽P25，再根據該多肽P25篩選出針對多肽P25的表位抗體，該多肽P25表位抗體能夠與新城疫病毒發生特異性反應，縮短了制備NDV多肽P25表位抗體的過程。

本發明為解決上述技術問題采用如下技術方案，一種能夠識別雞新城疫病毒的表位抗體的制備方法，其特征在于具體步驟為：

(1)新城疫病毒高免血清的制備，將新城疫病毒接種于雞成纖維細胞，72h后收獲病毒，用蔗糖梯度離心的方法純化新城疫病毒，以1mg/mL的濃度肌肉注射給2周齡的小雞，當出現臨床癥狀時采集血清，用多肽P25通過ELISA方法檢測抗體滴度，將收集到的血清于56℃滅活30min，-70℃保存備用，其中多肽P25的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.1 所示；

(2)多肽P25表位抗體的制備，根據Immobilization Kit試劑盒，將多肽 P25稀釋到500ug/mL，標記免疫親和層析柱，將制備的新城疫病毒高免血清通過免疫親和層析柱，最后用洗脫液洗脫多肽P25表位抗體，重復2～3次，將收集到的多肽P25單克隆抗體于-20℃保存備用。

本發明具有以下有益效果：本發明獲得的多肽P25單克隆抗體與雞新城疫病毒反應，顯示出高靈敏性和特異性。與其它家禽疾病如IBDV和AIV無交叉反應性，與血細胞凝集試驗高度一致。與HA試驗相比，該多肽P25單克隆抗體可以檢測5U NDV。此外，該方法制備NDV多肽P25單克隆抗體的方法大大縮短了常規方法制備NDV多肽P25表位抗體的時過程。

具體實施方式

以下通過實施例對本發明的上述內容做進一步詳細說明，但不應該將此理解為本發明上述主題的范圍僅限于以下的實施例，凡基于本發明上述內容實現的技術均屬于本發明的范圍。

實施例