[發明專利]一種利用里氏木霉分批補料發酵高效生產β-葡萄糖苷酶的方法

在審

• 申請號: 201810307675.9
• 申請日: 2018-04-08
• 公開（公告）號: CN110343685A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發明（設計）人: 李勇昊;姚波;朱蠡慶;冉佳靈;劉丹
• 申請（專利權）人: 重慶科技學院
• 主分類號: C12N9/42
• 分類號: C12N9/42;C12R1/885
• 代理公司: 重慶萃智邦成專利代理事務所(普通合伙) 50231
• 代理人: 竺棟

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用里氏木霉通過分批補料發酵高效生產β?葡萄糖苷酶的方法。該方法包括以下步驟：將重組里氏木霉（菌種保藏號CGMCC No.12768）接種至發酵培養基中，發酵24?28小時后開始分批補料培養，當溶氧高于21%時流加葡萄糖，當溶氧低于19%時停止流加，總發酵時間在100小時以內，β?葡萄糖苷酶活性超過70 IU/mL。本發明方法解決了β?葡萄糖苷酶生產過程中使用不可溶誘導物、高成本誘導物和生產強度低等問題，獲得的β?葡萄糖苷酶濃度高，可應用于生物能源及制備寡糖等領域。

技術領域

本發明屬于微生物發酵技術領域，具體涉及一種利用里氏木霉分批補料發酵高效生產β-葡萄糖苷酶的方法。

背景技術

β-葡萄糖苷酶又稱β-D-葡萄糖苷水解酶，該酶可以將結合于原子基團末端的非還原性糖苷鍵水解，從而釋放葡萄糖和配基分子。因此，該酶可以應用于生物能源領域，配合纖維素酶將木質纖維素徹底水解為葡萄糖用于生物發酵。β-葡萄糖苷酶可以催化高濃度葡萄糖合成纖維寡糖，纖維寡糖能促進體內有益雙歧桿菌等益生菌生長，從而達到保護腸道的作用；此外β-葡萄糖苷酶也可以在果汁、茶葉等飲料制備中起到改善風味的作用；還可以用于生產天然色素、表明活性劑及應用于少數腫瘤的診斷等，可見β-葡萄糖苷酶具有廣泛的需求前景。

目前β-葡萄糖苷酶通常采用發酵生產的方式，一種發酵生產的方式是使用曲霉在固態發酵下完成，然而固態發酵具有不宜擴大培養、容易染菌、發酵不容易控制以及產品不穩定等缺點（Journal of Fermentation and Bioengineering, 1989, 67, 6: 424-426，Biotechnology Progress, 1996, 13, 2: 166-169）。此外也可以采用液體深層發酵的方式，而在液體深層發酵方面曲霉菌發酵水平仍然較低，酶活只有9.3 IU/mL（ProcessBiochemistry, 2016 , 51, 10:1331-1337）。

里氏木霉是著名的纖維素降解真菌之一，屬于子囊菌。其于二戰期間在美軍軍營發現，在隨后的60多年研究中，經過不斷的誘變篩選，里氏木霉細胞外纖維素酶的產量可達40 g/L，甚至有報道聲稱達到100 g/L，里氏木霉最主要的特點是胞外蛋白分泌能力強，是良好的外源蛋白表達系統。發明人在之前的研究中，構建了以pdc1啟動子，曲霉來源的aabgl1和pdc1終止子的基因表達盒，導入里氏木霉后獲得基因工程菌（T. reesei CGMCCNo.12768），β-葡萄糖苷酶產量在搖瓶水平提高3-25倍，該菌種在發酵罐中以葡萄糖-槐糖混合物作為誘導物控制葡萄糖底物濃度分批補料發酵高效合成β-葡萄糖苷酶，具備工業化生產的潛力（CN105925551A）。但是制備葡萄糖-槐糖混合物需要以高濃度葡萄糖為底物，消耗大量β-葡萄糖苷酶，同時高溫催化72 h，能耗成本極高；并且以發酵液中葡萄糖濃度為指標控制的分批補料培養方案耗氧量極大，需要使用純氧來控制溶氧，同時隨時取樣并修改補料速度來控制培養基中葡萄糖濃度的工序復雜。

發明內容

本發明的目的在于：提供一種以廉價葡萄糖為底物，既能減少純氧消耗、又能簡化發酵流程的高效合成β-葡萄糖苷酶的方法。

本發明的技術方案是：利用里氏木霉分批補料發酵高效生產β-葡萄糖苷酶的方法，包括下述步驟：