[發明專利]構建B2m定點敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

有效

• 申請號: 201810305819.7
• 申請日: 2018-04-08
• 公開（公告）號: CN110343698B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張雅鷗;王子強;王松茂;許乃寒;張佩琢;謝偉東;張世寬
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院;蘇州吉瑪基因股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

本發明公開了一種構建B2m定點敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。該方法包括如下步驟：利用CRISPR/Cas9技術在目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子處定點敲入缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA。將Cas9mRNA、gRNA和同源重組載體(包含2kb 5’同源臂、Human B2M cDNA?3×polyA和2kb 3’同源臂)顯微注射到C57BL/6J小鼠的受精卵中，進而獲得相應的小鼠模型。人源B2M cDNA小鼠對HSV?1病毒或其它皰疹類DNA病毒易感，可用作動物模型篩查抗病毒藥物或研究病毒與宿主相互作用的機理。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，具體涉及一種構建B2m定點敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法。

背景技術

人的B2M的RNA轉錄本與鼠的不同，能促進HSV-1病毒的繁殖，因而人源B2M cDNA小鼠對HSV-1病毒或其它皰疹類DNA病毒易感，可用作動物模型篩查抗病毒藥物或研究病毒與宿主相互作用的機理。

CRISPR-Cas9本是細菌用于對抗入侵的病毒及外源DNA一種適應性免疫防御機制，經科研人員的努力目前已發展成為最有力的基因編輯技術。目前，來自Streptococcuspyogenes的CRISPR-Cas9系統應用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個核酸酶結構域，可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNA及tracrRNA結合成復合物，然后通過PAM序列結合并侵入DNA，形成RNA-DNA復合結構，進而對目的DNA雙鏈進行切割，使DNA雙鏈斷裂。由于PAM序列結構簡單(5’-NGG-3’)，幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點，因此得到廣泛的應用。CRISPR-Cas9系統已經成功應用于植物、細菌、酵母、魚類及哺乳動物細胞，是目前最高效的基因組編輯系統。

發明內容

本發明的目的是提供一種構建B2m定點敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法。

本發明所提供的構建B2m定點敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步驟：利用CRISPR/Cas9技術在目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子處定點敲入缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA。缺失了ATG才能只表達人源B2M mRNA，但不會轉錄出B2M蛋白，以非編碼核酸的形式發揮作用。

在本發明的一個實施例中，具體是利用CRISPR/Cas9技術將目的小鼠的基因組中自B2m基因的起始密碼子起向3’端延伸包括B2m基因的起始密碼子在內共計13個核苷酸替換為缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA及3xpolyA片段。只要是在目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子處定點敲入缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA理論上即可實現發明目的，ATG的缺失確保轉錄出的人源B2M以非編碼RNA的形式起作用，而3xpolyA片段的加入，使跟在人源B2M cDNA后面的鼠的B2m基因不會轉錄。

在所述方法中，作為被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因組中B2m基因中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數(如X＝23)，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸。

進一步地，所述靶序列為SEQ ID No.1或SEQ ID No.2。

在所述方法中，作為定點敲入工具的同源重組載體上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA、3個連續的polyA(3xpolyA片段)、3’同源臂；所述5’同源臂為位于所述目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子上游的2kb序列；所述3’同源臂為位于所述目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子下游的2kb序列。