[發明專利]構建B2m定點敲入人B2M cDNA小鼠模型的方法

有效

• 申請號: 201810305819.7
• 申請日: 2018-04-08
• 公開（公告）號: CN110343698B
• 公開（公告）日: 2021-03-30
• 發明（設計）人: 張雅鷗;王子強;王松茂;許乃寒;張佩琢;謝偉東;張世寬
• 申請（專利權）人: 清華大學深圳研究生院;蘇州吉瑪基因股份有限公司
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;張立娜

1.一種構建B2m定點敲入人源B2M cDNA的小鼠模型的方法，包括如下步驟：利用CRISPR/Cas9技術在目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子處定點敲入缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA；

在所述方法中，作為定點敲入工具的同源重組載體上含有如下DNA片段A；所述DNA片段A自上游到下游依次包含5’同源臂、缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA、3個連續的polyA、3’同源臂；所述5’同源臂為位于所述目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子上游的2kb序列；所述3’同源臂為位于所述目的小鼠的基因組中B2m基因的起始密碼子下游的2kb序列。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：在所述方法中，作為被Cas9核酸酶切割的靶序列是所述目的小鼠的基因組中B2m基因中符合5’-N_X-NGG-3’或5’-CCN-N_X-3’序列排列規則的片段；N表示A、G、C和T中的任一種，14≤X≤30，且X為整數，N_X表示X個連續的脫氧核糖核苷酸。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于：所述靶序列為SEQ ID No.1或SEQ IDNo.2。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于：所述5’同源臂的序列為SEQ ID No.3的第1-2000位；所述缺失起始密碼子ATG的人源B2M cDNA的序列為SEQ ID No.3的第2001-2984位；所述3個連續的polyA的序列為SEQ ID No.3的第3008-3758位；所述3’同源臂的序列為SEQ ID No.3的第3781-5780位。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于：所述DNA片段A的序列為SEQ ID No.3。

6.根據權利要求1-5中任一所述方法，其特征在于：所述方法包括如下步驟：

(1)將Cas9 mRNA、gRNA和權利要求1-5任一中所述的同源重組載體注射到所述目的小鼠的受精卵胞質中，得到F0代小鼠；

所述gRNA的序列為將SEQ ID No.1或SEQ ID No.2中的T替換為U后得到的序列；

(2)將步驟(1)獲得的所述F0代小鼠與所述目的小鼠進行雜交，從F1代小鼠中獲得B2m定點敲入人源B2M cDNA的雜合體小鼠。

7.根據權利要求6所述方法，其特征在于：在步驟(2)之后，還包括如下步驟：將雄性的所述雜合體小鼠與雌性的所述雜合體小鼠進行一次或多次雜交，從雜交后代中獲得B2m定點敲入人源B2M cDNA的純合體小鼠。

8.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述Cas9 mRNA的序列為SEQ ID No.4。

9.根據權利要求6所述的方法，其特征在于：所述同源重組載體為將SEQ ID No.3所示DNA片段插入到NM-322載體的第702位和第703位之間后得到的重組質粒；所述NM-322載體的全序列為SEQ ID No.5。

10.用于構建B2m定點敲入人源B2M cDNA小鼠模型的試劑盒，包括權利要求6或8中所述的Cas9 mRNA、權利要求6中所述的gRNA和權利要求6或9中所述的同源重組載體。

11.由權利要求1-9中任一所述方法構建得到的小鼠模型在篩查抗病毒藥物或研究病毒與宿主相互作用的機理中的應用。

12.由權利要求1-9中任一所述方法構建得到的小鼠模型在作為篩查抗病毒藥物或研究病毒與宿主相互作用的機理的動物模型中的應用。