[發明專利]一種玉米大斑病高效抗病鑒定接種體及其制備方法

在審

• 申請號: 201810304500.2
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108456712A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 蒙成;黃艷花
• 申請（專利權）人: 廣西農業職業技術學院
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18;C12N1/14;C12R1/645
• 代理公司: 廣州市紅荔專利代理有限公司 44214
• 代理人: 李彥孚;何承鑫

1.一種玉米大斑病高效抗病鑒定接種體，其特征在于：接種體由以下重量比的原料組成：小麥100g、甘露醇2.0～3.0g、玉米葉10～25g。

2.根據權利要求1所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法，其特征在于，步驟如下：

1）玉米大斑病強致病力菌株的篩選，先進行病菌的分離，然后用單細胞進行純化，采用柯赫氏法則進行病菌的驗證，最后通過常規菌株致病力的測定篩選出強致病力菌株；

2）玉米大斑病強致病力菌株的保存，把篩選到的強致病力菌株放入PCA斜面培養基中培養4～7d，放入4℃冰箱進行保存；

3）二級菌種的配制：活化后的菌株放入滅菌后的高粱粒培養基中在24～26℃培養6～7d，即得二級菌種；

4）接種體的配制，按配方配制原料，把所需原料混勻，濕度以藥品能溶解、玉米葉能摻和在籽粒上而無滴水為度，配好的培養基裝入三角瓶中，以不超過培養瓶二分之一的空間為度，套上三角瓶塞，瓶塞外蓋一層牛皮紙，用膠卷固定，經過121帕高壓滅菌45～100min備用；

5）接種體的培養：把在高粱粒上培養的二級菌種混入接種體上，每100g接種體接種5～10g二級菌種，在20℃條件下光暗交替各12 h、光照強度為2000lx條件下對其進行培養7～8d，菌絲長滿接種體后在無菌操作條件下用木棒把帶菌絲的培養基進行充分攪拌，把三角瓶內塞去掉，留下牛皮紙繼續把瓶口封住，菌瓶放在原培養箱繼續培養6～8d即可得到玉米大斑病高效抗病鑒定接種體。

3.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法，其特征在于：所述步驟1）單細胞純化的方法采用標記法單細胞純化，具體步驟為：在培養皿中倒入10ml薄層PDA培養基，把稀釋好的孢子懸浮液布滿在培養基上，孢子懸浮液在100倍鏡下每視野1～2個孢子的濃度，用封口薄膜把培養皿套口封上，移入26～30℃的培養箱進行培養8～10h；用低倍鏡從培養皿反面檢查，挑選在視野內只有1個已經萌發的孢子，且其附近沒有其它孢子或菌絲存在，用記號筆對著孢子存在的位置在培養皿反面畫上一個小點作記號，培養皿繼續放在24～26℃的培養箱進行培養3～5d，標記處的孢子長出的菌落即為該病菌的單細胞菌落。

4.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法，其特征在于：所述步驟2）中，PCA培養基的配方為：馬鈴薯20g、胡蘿卜20g、瓊膠16～20g、水1000ml。

5.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法，其特征在于：所述步驟4）按配方配制原料前，對原料小麥、玉米葉進行處理，處理方法為：挑選籽粒飽滿、大小一致、無病蟲的帶皮小麥粒清水浸泡18～25min，水煮15～20min，水洗瀝干備用；玉米葉用剛從大田采集的新鮮玉米葉切成約1cm²的碎片備用。

6.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法制備得到的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體在玉米抗病性鑒定中的應用，其特征在于：采用帶菌接種體接種法，所述具體步驟為：在玉米10～13葉時，把培養好的接種體接種于玉米心葉內，每株接種2～4g菌粒，接種后田間保濕7d，在玉米乳熟期調查玉米葉片發病情況，評價玉米對該病菌的抗病情況。

7.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法制備得到的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體在玉米抗病性鑒定中的應用，其特征在于：采用菌液灌心接種法，所述具體步驟為：把培養好的接種體用加有Tween-20的2%蔗糖溶液洗滌，Tween-20的濃度為0.01%，制成濃度為3×10⁷個孢子/mL 的分生孢子懸浮液，在玉米第10～13葉時用移液槍將菌懸液接種至玉米心葉內，3mL/株，接種前先進行田間澆灌，接種后連續3d早晚對葉面噴水保濕，在玉米乳熟期調查玉米葉片發病情況，評價玉米對該病菌的抗病情況。

8.根據權利要求2所述的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體的制備方法制備得到的玉米大斑病高效抗病鑒定接種體在玉米抗病性鑒定中的應用，其特征在于：采用孢子懸浮液噴霧法，所述具體步驟為：把培養好的接種體加水淘洗，紗布過濾，加0.01% 吐溫(v/v)配制成孢子懸浮液，懸浮液中分生孢子濃度調至1×10⁵～3×10⁵個孢子/mL，在玉米第10～13葉時將孢子懸浮液對玉米植株進行噴霧接種，每株噴霧7～10ml菌液，接種前先進行田間澆灌，接種后連續3d早晚對葉面噴水保濕，在玉米乳熟期調查玉米葉片發病情況，評價玉米對該病菌的抗病情況。