[發(fā)明專(zhuān)利]治療子宮內(nèi)膜損傷和卵巢早衰的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及外泌體的聯(lián)合制劑、制備方法與給藥方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810304218.4
• 申請(qǐng)日: 2018-04-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109893543A
• 公開(kāi)（公告）日: 2019-06-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 魯振宇;張冰晶;韓洪起;牟鑫煜;徐悅
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 天津欣普賽爾生物醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): A61K35/48
• 分類(lèi)號(hào): A61K35/48;A61P15/00;C12N5/071
• 代理公司: 天津才智專(zhuān)利商標(biāo)代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

本發(fā)明公開(kāi)了一種治療子宮內(nèi)膜損傷和卵巢早衰的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及外泌體的聯(lián)合制劑和其制備方法與給藥方法。包括子宮內(nèi)膜干細(xì)胞以及通過(guò)饑餓培養(yǎng)獲得子宮內(nèi)膜干細(xì)胞外泌體濃縮液。通過(guò)對(duì)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞饑餓培養(yǎng)的方法，促進(jìn)其生物活性物質(zhì)的分泌。以外泌體的形式回收子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分泌的生物活性物質(zhì)，大大提高了回收效率、回收方式更為簡(jiǎn)便。通過(guò)不同孔徑的生物膜梯度過(guò)濾的方法，收集并濃縮子宮內(nèi)膜干細(xì)胞分泌的外泌體，簡(jiǎn)化了外泌體回收的流程，提高了外泌體的純度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及其外泌體的聯(lián)合制劑，尤其是一種治療子宮內(nèi)膜損傷和卵巢早衰的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及外泌體的聯(lián)合制劑、制備方法與給藥方法。

背景技術(shù)

子宮內(nèi)膜損傷主要為內(nèi)膜基底層的損傷，其主要原因與妊娠期刮宮有關(guān)，與正常子宮內(nèi)膜相比，妊娠期子宮內(nèi)膜基底層疏松，更容易受到損傷。基于我國(guó)國(guó)情以及人工流產(chǎn)率逐漸增加的現(xiàn)狀，子宮內(nèi)膜受損的發(fā)生情況不容忽視。子宮內(nèi)膜基底層受損，可能導(dǎo)致子宮內(nèi)膜干細(xì)胞受損或缺失；與此同時(shí)，損傷內(nèi)膜局部的感染和無(wú)菌性炎癥會(huì)破壞干細(xì)胞的壁龕微環(huán)境，造成上皮和間質(zhì)細(xì)胞再生修復(fù)發(fā)生障礙，血管形成受阻，致密纖維組織形成，最終導(dǎo)致宮腔僅覆蓋少量?jī)?nèi)膜，甚至無(wú)內(nèi)膜，腺體萎縮，宮腔失去正常形態(tài)及功能。

子宮內(nèi)膜干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，具有多向分化、組織修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)等多種功能，在臨床應(yīng)用中具有極大的優(yōu)勢(shì)。研究顯示，子宮內(nèi)膜干細(xì)胞能夠一定程度上治療和緩解子宮內(nèi)膜損傷。但是，直接靜脈回輸臍帶子宮內(nèi)膜干細(xì)胞由于細(xì)胞難于到達(dá)子宮部位，所以治療效果有限。

研究發(fā)現(xiàn)，干細(xì)胞行使生物學(xué)功能的一個(gè)最重要途徑是通過(guò)分泌大量生物活性因子，進(jìn)而調(diào)節(jié)病變組織的機(jī)能、促進(jìn)血管再生、加速組織再生修復(fù)。而大量的生物活性因子的分泌途徑主要是通過(guò)外泌體，一種生物膜包括的，直徑在40-200nm不等的分泌小泡。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是，提供一種治療子宮內(nèi)膜損傷和卵巢早衰的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及外泌體的聯(lián)合制劑、制備方法與給藥方法，通過(guò)饑餓培養(yǎng)子宮內(nèi)膜干細(xì)胞并進(jìn)行富集濃縮的方法，獲得高濃度的具有生物活性的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞外泌體，將外泌體與子宮內(nèi)膜干細(xì)胞聯(lián)合制備制劑通過(guò)直接注射入子宮內(nèi)部用于治療子宮內(nèi)膜損傷。

為了解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：一種用于治療子宮內(nèi)膜損傷和卵巢早衰的子宮內(nèi)膜干細(xì)胞及其外泌體的聯(lián)合制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，微生物檢測(cè)均為陰性的，P2-P8的人源子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有體積比濃度5-15％的胎牛血清的培養(yǎng)體系；

(2)接種培養(yǎng)2-4天后，細(xì)胞融合率達(dá)到80-95％，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好，吸棄全部培養(yǎng)上清，并以醫(yī)用復(fù)方電解質(zhì)注射液清洗細(xì)胞2-4次，然后加入適量復(fù)方電解質(zhì)溶液，使溶液高度達(dá)到2-3mm，放入二氧化碳培養(yǎng)箱中饑餓培養(yǎng)；

(3)饑餓培養(yǎng)18-30h后，回收全部培養(yǎng)上清，以0.22um孔徑濾膜過(guò)濾，過(guò)濾后的培養(yǎng)上清在3000-5000g的離心力條件下離心10-20min，再次回收離心上清；

(4)在200000-500000g的離心力條件下對(duì)回收的上清離心30-60min，離心后輕輕取出離心管，以移液管吸棄上部70％-90％體積的液體，將下部10％-30％體積的液體及沉淀混合均勻后作為制備子宮內(nèi)膜治療制劑的外泌體溶劑，在2-8℃條件下保存；

(5)人子宮內(nèi)膜干細(xì)胞的培養(yǎng)：選取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的，微生物檢測(cè)均為陰性的，P2-P8的人源子宮內(nèi)膜干細(xì)胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶或細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基中含有體積比濃度5-15％的胎牛血清的培養(yǎng)體系；