[發明專利]治療子宮內膜損傷和卵巢早衰的子宮內膜干細胞及外泌體的聯合制劑、制備方法與給藥方法

在審

• 申請號: 201810304218.4
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN109893543A
• 公開（公告）日: 2019-06-18
• 發明（設計）人: 魯振宇;張冰晶;韓洪起;牟鑫煜;徐悅
• 申請（專利權）人: 天津欣普賽爾生物醫藥科技有限公司
• 主分類號: A61K35/48
• 分類號: A61K35/48;A61P15/00;C12N5/071
• 代理公司: 天津才智專利商標代理有限公司 12108
• 代理人: 王曉紅

本發明公開了一種治療子宮內膜損傷和卵巢早衰的子宮內膜干細胞及外泌體的聯合制劑和其制備方法與給藥方法。包括子宮內膜干細胞以及通過饑餓培養獲得子宮內膜干細胞外泌體濃縮液。通過對子宮內膜干細胞饑餓培養的方法，促進其生物活性物質的分泌。以外泌體的形式回收子宮內膜干細胞分泌的生物活性物質，大大提高了回收效率、回收方式更為簡便。通過不同孔徑的生物膜梯度過濾的方法，收集并濃縮子宮內膜干細胞分泌的外泌體，簡化了外泌體回收的流程，提高了外泌體的純度。

技術領域

本發明涉及子宮內膜干細胞及其外泌體的聯合制劑，尤其是一種治療子宮內膜損傷和卵巢早衰的子宮內膜干細胞及外泌體的聯合制劑、制備方法與給藥方法。

背景技術

子宮內膜損傷主要為內膜基底層的損傷，其主要原因與妊娠期刮宮有關，與正常子宮內膜相比，妊娠期子宮內膜基底層疏松，更容易受到損傷。基于我國國情以及人工流產率逐漸增加的現狀，子宮內膜受損的發生情況不容忽視。子宮內膜基底層受損，可能導致子宮內膜干細胞受損或缺失；與此同時，損傷內膜局部的感染和無菌性炎癥會破壞干細胞的壁龕微環境，造成上皮和間質細胞再生修復發生障礙，血管形成受阻，致密纖維組織形成，最終導致宮腔僅覆蓋少量內膜，甚至無內膜，腺體萎縮，宮腔失去正常形態及功能。

子宮內膜干細胞屬于成體干細胞，具有多向分化、組織修復、免疫調節等多種功能，在臨床應用中具有極大的優勢。研究顯示，子宮內膜干細胞能夠一定程度上治療和緩解子宮內膜損傷。但是，直接靜脈回輸臍帶子宮內膜干細胞由于細胞難于到達子宮部位，所以治療效果有限。

研究發現，干細胞行使生物學功能的一個最重要途徑是通過分泌大量生物活性因子，進而調節病變組織的機能、促進血管再生、加速組織再生修復。而大量的生物活性因子的分泌途徑主要是通過外泌體，一種生物膜包括的，直徑在40-200nm不等的分泌小泡。

發明內容

本發明所要解決的技術問題是，提供一種治療子宮內膜損傷和卵巢早衰的子宮內膜干細胞及外泌體的聯合制劑、制備方法與給藥方法，通過饑餓培養子宮內膜干細胞并進行富集濃縮的方法，獲得高濃度的具有生物活性的子宮內膜干細胞外泌體，將外泌體與子宮內膜干細胞聯合制備制劑通過直接注射入子宮內部用于治療子宮內膜損傷。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：一種用于治療子宮內膜損傷和卵巢早衰的子宮內膜干細胞及其外泌體的聯合制劑的制備方法，包括以下步驟：

(1)人子宮內膜干細胞的培養：選取生長狀態良好的，微生物檢測均為陰性的，P2-P8的人源子宮內膜干細胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接種于細胞培養瓶或細胞培養皿中，培養基為基礎培養基中含有體積比濃度5-15％的胎牛血清的培養體系；

(2)接種培養2-4天后，細胞融合率達到80-95％，細胞生長狀態良好，吸棄全部培養上清，并以醫用復方電解質注射液清洗細胞2-4次，然后加入適量復方電解質溶液，使溶液高度達到2-3mm，放入二氧化碳培養箱中饑餓培養；

(3)饑餓培養18-30h后，回收全部培養上清，以0.22um孔徑濾膜過濾，過濾后的培養上清在3000-5000g的離心力條件下離心10-20min，再次回收離心上清；

(4)在200000-500000g的離心力條件下對回收的上清離心30-60min，離心后輕輕取出離心管，以移液管吸棄上部70％-90％體積的液體，將下部10％-30％體積的液體及沉淀混合均勻后作為制備子宮內膜治療制劑的外泌體溶劑，在2-8℃條件下保存；

(5)人子宮內膜干細胞的培養：選取生長狀態良好的，微生物檢測均為陰性的，P2-P8的人源子宮內膜干細胞，按照3-5*10⁴/cm²的初始密度接種于細胞培養瓶或細胞培養皿中，培養基為基礎培養基中含有體積比濃度5-15％的胎牛血清的培養體系；