[發(fā)明專利]一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法

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• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108504777A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發(fā)明（設計）人: 張鐵漢;楊根慶;楊秀珍;張曉文;劉燕子
• 申請（專利權）人: 新鄉(xiāng)醫(yī)學院第三附屬醫(yī)院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/682
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

本發(fā)明屬于病毒診斷技術領域，特別涉及一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，分別設計HCV病毒型別中HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b5種型別的特異性引物，檢測樣品、通用捕獲引物和裂解液混合裂解，再加入檢測探針緩沖液進行雜交，經放大分子溶液放大后依次加探針標記物和底物，完成捕獲雜交后的信號放大，最后用化學發(fā)光檢測信號獲得樣品中HCV病毒載量。本發(fā)明的敏感性在200?300個HCV病毒拷貝才能檢測到，對于臨床患者的病毒載量的監(jiān)測其敏感性是足夠的，可有效避免測定結果假陽性的基礎上，簡便、快速地實現(xiàn)對樣品中HCV?RNA準確定量。

技術領域

本發(fā)明屬于病毒診斷技術領域，特別涉及一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法。

背景技術

丙型病毒性肝炎，簡稱為丙型肝炎、丙肝，是一種由丙型肝炎病毒(HCV)感染引起的病毒性肝炎，主要經輸血、針刺、吸毒等傳播，據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計，全球HCV的感染率約為3％，估計約1.8億人感染了HCV，每年新發(fā)丙型肝炎病例約3.5萬例。丙型肝炎呈全球性流行，可導致肝臟慢性炎癥壞死和纖維化，部分患者可發(fā)展為肝硬化甚至肝細胞癌(HCC)。未來20年內與HCV感染相關的死亡率(肝衰竭及肝細胞癌導致的死亡)將繼續(xù)增加，對患者的健康和生命危害極大，已成為嚴重的社會和公共衛(wèi)生問題。在我國健康人群抗HCV陽性率為0.7％～3.1％，約3800萬人。由于病毒生物學特點和宿主免疫功能等多方面因素，機體免疫往往難以有效清除病毒，致使約50％～80％HCV感染者發(fā)展為慢性肝炎，其中20％～30％將發(fā)展成肝硬化。肝硬化患者中每年有1％～4％發(fā)展成為肝細胞癌癥，丙肝已成為我國危害國民健康的重大疾病之一。

索磷布韋可與其他藥物聯(lián)合，治療所有基因型的丙型肝炎病毒感染效果良好。該藥2013年美國上市，2017.9中國上市。目前，慢性丙肝抗病毒治療方法普遍采用聚乙二醇干擾素α聯(lián)合利巴韋林，但治療的患者中大概有十分之一是不能耐受干擾素治療，還有一些干擾素治療無應答、復發(fā)的患者，都因為無法實時檢測出病人HCV病毒載量的水平變化而難以實時評估患者的治療效果，所以會導致藥物的無效治療浪費，產生不必要的費用，甚至耽誤患者病情。另外，現(xiàn)有HCV病毒核酸檢測RT-PCR中易出現(xiàn)的RNA降解和污染問題，無法進一步提高病毒的篩出率，高敏HCV-RNA檢測技術成本太高，限制了部分患者的臨床應用。為此，本發(fā)明設計了一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，可對病人血液中一段時間內的HCV病毒載量水平做線性評估。

發(fā)明內容

本發(fā)明的敏感性在200-300個HCV病毒拷貝才能檢測到，對于臨床患者的病毒載量的監(jiān)測其敏感性是足夠的，可有效避免測定結果假陽性的基礎上，簡便、快速地實現(xiàn)對樣品中HCV-RNA準確定量。

本發(fā)明提供了一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，包括如下步驟：

S1，準備待檢測樣品，所述待檢測樣品為血清、血漿、全血中的其中一種；

S2，針對HCV病毒型別設計特異性引物，每個HCV病毒型別的特異性引物數(shù)量≥8條；

S3，將濃度為1pmol/ul的通用捕獲引物溶液包被在孔微板中，在避光密閉條件下冷藏24h，然后再恢復到室溫，待用，所述通用捕獲引物的序列如SEQ ID NO.54所示；

S4，向S3的孔微板中加入S1中檢測樣品和裂解液，其中S1中檢測樣品、S3中通用捕獲引物溶液、裂解液體積比為1:2:2，65℃裂解1h，得裂解樣品；

其中，裂解液由以下質量濃度的組分組成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸鋰，余量為去離子水；

S5，向裂解樣品加入相當于S1中檢測樣品2倍體積量的檢測探針緩沖液，55℃雜交3～5h，得雜交樣品；

其中，所述檢測探針緩沖液由S2中特異性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的體積比組成；