[發明專利]一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法

在審

• 申請號: 201810303707.8
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108504777A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 張鐵漢;楊根慶;楊秀珍;張曉文;劉燕子
• 申請（專利權）人: 新鄉醫學院第三附屬醫院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/682
• 代理公司: 西安銘澤知識產權代理事務所(普通合伙) 61223
• 代理人: 俞曉明

1.一種基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1，準備待檢測樣品，所述待檢測樣品為血清、血漿、全血中的其中一種；

S2，針對HCV病毒型別設計特異性引物，每個HCV病毒型別的特異性引物數量≥8條；

S3，將濃度為1pmol/ul的通用捕獲引物溶液包被在孔微板中，在避光密閉條件下冷藏24h，然后再恢復到室溫，待用，所述通用捕獲引物的序列如SEQ ID NO.54所示；

S4，向S3的孔微板中加入S1中檢測樣品和裂解液，其中S1中檢測樣品、S3中通用捕獲引物溶液、裂解液體積比為1:2:2，65℃裂解1h，得裂解樣品；

其中，裂解液由以下質量濃度的組分組成：10％的EDTA、2.53％的Hepes、1.79％的Tris、15％的十二烷基硫酸鋰，余量為去離子水；

S5，向裂解樣品加入相當于S1中檢測樣品2倍體積量的檢測探針緩沖液，55℃雜交3～5h，得雜交樣品；

其中，所述檢測探針緩沖液由S2中特異性引物混合物、所述裂解液、蛋白酶K溶液以1:50:49的體積比組成；

S6，用洗液洗含有S5的微孔板，然后加入相當于S1中檢測樣品2倍體積量的放大分子溶液，55℃溫育35min，得初步放大溶液；

S7，用洗液洗含有S6的微孔板，然后加入相當于S1中檢測樣品2倍體積量的放大分子溶液，55℃溫育35min，得放大溶液；

S8，用洗液洗含有S7的微孔板，加入相當于S1中檢測樣品2倍體積量的探針標記溶液，50℃溫育35min，得標記溶液；

其中，探針標記溶液由以下質量濃度的組分組成：0.05％標記探針、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl₂、0.5％ZnCl₂、余量為去離子水，所述標記探針的序列如SEQ IDNO.56所示；

S9，用洗液洗含有S8的微孔板，然后加入S1中檢測樣品2倍體積量的底物溶液，30℃溫育15min，得到待檢測溶液；

其中，底物溶液由以下質量濃度的組分組成：1.5％的CDP-Star、余量為增強劑組成；

S10，將S9中待檢測溶液置于化學發光分析儀上讀數，再對照標準曲線計算得檢測樣品中HCV病毒載量。

2.如權利要求1所述的基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，其特征在于，S1中血漿是經乙二胺四乙酸二鉀或枸櫞酸鹽抗凝處理后的。

3.如權利要求1所述的基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，其特征在于，S1中全血在18℃-30℃中儲存≤4h，或者18℃-30℃中儲存≥4h則離心10-15min，或者2℃-8℃中儲存≤48h，或者-20℃儲存≤72h。

4.如權利要求1所述的基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，其特征在于，S2中所述HCV病毒型別包括HCV1b、HCV2a、HCV3a、HCV3b、HCV6b；其中HCV1b對應的特異性引物的核酸序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.13所示，HCV2a對應的特異性引物的核酸序列如SEQ IDNO.14～SEQ ID NO.23所示，HCV3a對應的特異性引物的核酸序列如SEQ ID NO.24～SEQ IDNO.35所示，HCV3b對應的特異性引物的核酸序列如SEQ ID NO.36～SEQ ID NO.45所示，HCV6b對應的特異性引物的核酸序列如SEQ ID NO.46～SEQ ID NO.53所示。

5.如權利要求1所述的基于信號放大檢測HCV病毒載量的方法，其特征在于，S6中洗液是由以下質量濃度的組分組成：1.5％的SSC、0.5％的十二烷基硫酸鋰、余量為去離子水；放大分子溶液由以下質量濃度的組分組成：0.05％放大分子探針、3.75％Hepes、5.3％Tris、7.5％MgCl₂、0.5％ZnCl₂、余量為去離子水，所述放大分子探針的序列如SEQ ID NO.55所示。