[發(fā)明專利]一種采用DNA及PCR技術(shù)鑒定新鮮羊肉貯藏時(shí)間的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810301927.7
• 申請(qǐng)日: 2018-04-04
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108588187B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永峰;趙晶
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 陜西師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/6851
• 分類號(hào): C12Q1/6851
• 代理公司: 西安永生專利代理有限責(zé)任公司 61201
• 代理人: 高雪霞

1.一種采用DNA及PCR技術(shù)鑒定新鮮羊肉貯藏時(shí)間的方法，其特征在于該方法由以下步驟組成：

（1）分離提取貯藏的羊肉樣品中羊DNA，并對(duì)DNA含量進(jìn)行檢測(cè)；

（2）以提取的羊DNA為模板，采用羊線粒體基因16S rRNA和內(nèi)參基因β-globin2的引物分別進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得羊線粒體基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增產(chǎn)物的ct值，計(jì)算Δct值，Δct值的計(jì)算公式為：Δct=∣ct_{羊線粒體基因}-ct_{內(nèi)參基因}∣；

所述羊內(nèi)參基因的引物序列如下：

上游引物：5’-CGGCGGCGGGCGGCGCGGGCTGGGCGGGAAGGCCCATGGCAAGAAGG-3’；

下游引物：5’-GCCGGCCCGCCGCGCCCGTCCCGCCGCTCACRCAGCGCAGCAAAGG-3’；

所述羊線粒體基因16S rRNA的引物序列如下：

上游引物：5’-GGTTCGTTTGTTCAACGATTAA-3’；

下游引物：5’-AGATAGAAACCGACCTGGATT-3’；

（3）4℃溫度下貯藏5天以內(nèi)的羊肉樣品，若DNA含量大于800μg/g，說(shuō)明羊肉樣品是一級(jí)鮮肉；若DNA含量在800μg/g以下，說(shuō)明羊肉樣品是一級(jí)鮮肉或二級(jí)鮮肉，將羊肉樣品繼續(xù)貯藏1天，若DNA含量增加說(shuō)明羊肉樣品是二級(jí)鮮肉，若DNA含量減小說(shuō)明羊肉樣品是一級(jí)鮮肉；若羊肉樣品為一級(jí)鮮肉，貯藏時(shí)間與Δct值擬合的數(shù)學(xué)方程為Y₂ = 1.5351X -16.027，其中Y₂代表貯藏天數(shù)，R² = 0.9901；若羊肉樣品為二級(jí)鮮肉，貯藏時(shí)間與Δct值擬合的數(shù)學(xué)方程為Y₂ = -1.3242X+17.394，R²=0.9891。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用DNA及PCR技術(shù)鑒定新鮮羊肉貯藏時(shí)間的方法，其特征在于分離提取貯藏的羊肉樣品中羊DNA的方法為：

（1）稱取0.3g羊肉糜于2mL離心管中，加入550μL DNA提取緩沖液、150μL 5% SDS裂解液及18μL 20mg/mL的蛋白酶K水溶液，于55℃下水浴消化4小時(shí)，然后加入700μL苯酚，搖晃10min，于12000r/min下離心10min；

（2）取上清液置于新離心管中，加入400μL苯酚與氯仿、異戊醇體積比為25:24:1的混合液，搖晃10min，于12000r/min下離心10min，再將上清液置于新離心管中，加入400μL氯仿與異戊醇體積比為24:1的混合液，搖晃10min，于12000r/min下離心10min；

（3）重復(fù)步驟（2）一次，取上清液置于新離心管中，加入800μL的冰無(wú)水乙醇，反復(fù)搖勻后，置于冰箱中-18℃靜置30min，靜置后于12000r/min下離心10min，棄去上層清液，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的冰乙醇水溶液，用槍頭反復(fù)吹打離心管中的溶液，然后于12000r/min下離心10min，棄去上層清液在通風(fēng)櫥內(nèi)風(fēng)干30min后，加入50μL TE溶解DNA，置于冷藏冰箱中，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用DNA及PCR技術(shù)鑒定新鮮羊肉貯藏時(shí)間的方法，其特征在于所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系為：DNA 1μL，2×Ultal SYBR Mixture 5μL，上、下游引物各0.3μL，ddH₂O 3.4μL。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的采用DNA及PCR技術(shù)鑒定新鮮羊肉貯藏時(shí)間的方法，其特征在于所述熒光定量PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃變性10min，以95℃ 15s、63℃ 30s、72℃ 30s擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。