[發(fā)明專利]一種利用微波酸水解和陰離子交換色譜-脈沖安培法分析多糖中單糖組成的檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810295008.3
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN110346457A
• 公開（公告）日: 2019-10-18
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張麗娟;何燕利
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)附屬醫(yī)院
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06
• 代理公司: 青島合創(chuàng)知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 37264
• 代理人: 王曉曉

本發(fā)明提供了一種利用微波酸水解和陰離子交換色譜?脈沖安培法分析多糖中單糖組成的檢測方法。本發(fā)明涉及使用單模微波蛋白水解儀將多糖降解為單糖，再應(yīng)用陰離子交換色譜?脈沖安培法分析多糖的單糖組成。本發(fā)明的技術(shù)方案具有水解快速，10分鐘可完成樣品降解；一次可降解10個樣品；與傳統(tǒng)方法使用相同的酸；酸用量少，只需10μL 3 mol/L HCl；操作步驟簡單易學(xué)、無需衍生和直接上樣等優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用微波酸水解和陰離子交換色譜-脈沖安培法分析多糖中單糖組成的檢測方法。

背景技術(shù)

大多數(shù)對多糖的單糖組成分析方法分為兩步：酸水解和單糖衍生后檢測。這兩個步驟都需要克服降解多糖的一些特殊的化學(xué)和非光學(xué)特性。例如，為了避免副反應(yīng)，酸水解步驟需要在密封的安瓿瓶里1mL酸水解10μL多糖樣品3-6h。用酸量大，污染環(huán)境，耗時長且操作繁瑣。

多糖或聚糖的復(fù)雜性不僅僅由于它們沒有生物合成模板，也由于不同的單糖組成，包括中性，酸性和堿性單糖。另外，單糖之間特殊的連接方式會形成線性，分支，均一或者雜多糖或者聚糖。因此，多糖不是純的化合物，由于分子量的多元化，連接位置，多糖組成，生物活性，這些對于多糖藥物、保健品和其他的生物產(chǎn)品(肝素，硫酸軟骨素，巖藻多糖，藻酸雙酯鈉，殼聚糖，α-和β-環(huán)糊精)來說，都是重要的質(zhì)量控制問題。對于藥用多糖來說，質(zhì)控中多糖的單糖組成分析是十分必要的。然而，在沒有酸的水解條件下，不同的單糖釋放速率不同，甚至在特殊的糖苷鍵連接的多糖中，同一種單糖的釋放速率也不同。然而，在酸性環(huán)境中，高溫度時(～100℃)，相對于中性和堿性單糖來說，釋放的酸性單糖不穩(wěn)定。為了克服這個問題，在Pico-Tag工作站中用6mol/L HCl水解富含GlcN/GalN的多糖(如肝素，硫酸軟骨素)，水解3h。在這個方法中，反應(yīng)管被放在Pico-Tag工作站的真空/氣體交換端口。反應(yīng)管抽真空直到里面的鹽酸開始冒泡，然后充滿氮氣。幾個循環(huán)之后，關(guān)閉氮氣閥。之后，反應(yīng)管被放在Pico-Tag工作站的烘箱中，100℃反應(yīng)3h。隨后，將酸蒸出，終止酸水解。但是，在過去的20年里，大多數(shù)蛋白質(zhì)的cDNA測序完成后，用于蛋白質(zhì)氨基酸組成分析的Pico-Tag工作站在市場上是沒有的。

由于沒有相應(yīng)的設(shè)備阻隔水解反應(yīng)管中的氧氣，大多數(shù)的實驗室選擇另一種替代方法來水解多糖，就是在密封的安瓿瓶里用1mL 2mol/L trifluoroacetic acid(TFA)在100℃條件下，水解10μL多糖樣品需要4h來釋放中性單糖。水解后，需要大約6h移除水解樣品中的TFA，之后，用PMP衍生單糖進(jìn)行HPLC分析。這種傳統(tǒng)的方法，水解需要4h，移除酸需要大約6h，70℃衍生需要1h，萃取移除PMP需要40min。

自從有報道將家用微波爐用于快速的有機合成，微波爐也變成了一種高效的非傳統(tǒng)的方法用于糖蛋白的脫糖基化工具。然而，家用微波爐的反應(yīng)條件很難控制。這種新穎的類似于Pico-Tag工作站的微波系統(tǒng)-CEM Discover單模微波蛋白水解儀，還沒有被報道用于多糖的單糖組成分析。

發(fā)明內(nèi)容

由于傳統(tǒng)烘箱水解方法用酸量大、污染環(huán)境、耗時長且操作繁瑣的問題，本發(fā)明的目的是提供了一種利用微波酸水解和陰離子交換色譜-脈沖安培法分析多糖中單糖組成的檢測方法。

為實現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實現(xiàn)：

本發(fā)明提供了一種利用微波酸水解和陰離子交換色譜-脈沖安培法分析多糖中單糖組成的檢測方法，所述檢測方法包括以下步驟：

(1)稱取待測多糖，用HCl溶解待測多糖得到溶解液，取所述溶解液使用單模微波蛋白水解儀進(jìn)行微波酸水解；

(2)微波酸水解后的水解液離心濃縮除酸；

(3)離心后的樣品中添加甲醇，離心濃縮除殘留HCl；

(4)將得到的干燥樣品用水溶解，離心取上清；