[發(fā)明專利]一種唾液酸酶基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810293790.5
• 申請日: 2018-04-04
• 公開（公告）號: CN108486154A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵敬偉;張冰晨
• 申請（專利權(quán)）人: 福州大學(xué)
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;A01K67/027
• 代理公司: 福州元創(chuàng)專利商標(biāo)代理有限公司 35100
• 代理人: 蔡學(xué)俊;饒文君

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，提供一種唾液酸酶基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用，利用一種體內(nèi)外靶向小鼠基因組NPL基因重組CRISPR敲除質(zhì)粒載體，通過受精卵顯微注射技術(shù)成功建立二倍體雙敲NPL小鼠敲除模型。NPL在機(jī)體的病理生理過程中發(fā)揮著重要的作用，腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化常常伴隨著唾液酸的過表達(dá)，現(xiàn)如今已成為腫瘤的惡性轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)移重要標(biāo)志物之一。該模型為研究細(xì)胞癌變的過程研究搭建了新的研究平臺，有利于研究腫瘤的生成及轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，同時為新型抗腫瘤藥物的研發(fā)提供了基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因編輯技術(shù)領(lǐng)域，涉及分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)和遺傳學(xué)等研究方法，具體涉及一種唾液酸酶基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

基因敲除小鼠模型的建立，為精準(zhǔn)的研究基因與人類疾病作用關(guān)系創(chuàng)造了可能。自從轉(zhuǎn)基因動物誕生以來，便得到了人們極大的重視，隨著近年不斷發(fā)展和完善，轉(zhuǎn)基因動物已經(jīng)逐漸開始在多個領(lǐng)域之中發(fā)揮著及其巨大的作用，對于整個社會來說，這些轉(zhuǎn)基因動物極大的促進(jìn)了社會經(jīng)濟(jì)和科學(xué)研究的發(fā)展。構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型，特別是基因敲除和敲入的動物模型是研究基因功能最直觀可靠的途徑之一，特別是為腫瘤的發(fā)生發(fā)展研究開辟了新的平臺與方向。基因敲除小鼠構(gòu)建的敲除方法發(fā)展至今，主要有ES細(xì)胞打靶技術(shù)、TALEN技術(shù)和Cre/loxP條件敲除等方法，隨著CRISPR/Cas9技術(shù)的發(fā)展，因其具有的靶向性強(qiáng)、敲除效率高以及操作方便等優(yōu)點，因而十分適用于目標(biāo)基因敲除小鼠的制備。

顯微注射技術(shù)，顯微注射是較早發(fā)展用于將外源基因?qū)氲郊?xì)胞中構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物的方法之一，但是外源DNA片段如果通過非同源重組的方式整合進(jìn)入宿主基因組，其整合隨機(jī)性非常大且效率較低。使用CRISPR/Cas9技術(shù)與顯微注射技術(shù)的結(jié)合，能夠大大解決敲除小鼠制備周期過長的困擾，同時實現(xiàn)對受精卵和胚胎達(dá)到精確基因編輯的需要。

唾液酸與腫瘤發(fā)生及惡化有著極大的關(guān)系，研究表明，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化常常伴隨著唾液酸的過表達(dá)。有效構(gòu)建一種穩(wěn)定、NPL基因完全敲除的小鼠將大大有利于探索NPL基因及其相關(guān)通路在腫瘤粘附轉(zhuǎn)移中達(dá)到的關(guān)鍵作用，促進(jìn)NPL相關(guān)互作基因的研究發(fā)現(xiàn)，為腫瘤惡化轉(zhuǎn)移的研究及相關(guān)藥物篩選搭建了新的研究平臺。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在提供一種唾液酸酶基因敲除小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。包括在鼠源細(xì)胞驗證有效的靶向NPL基因sgRNA重組敲除CRISPR質(zhì)粒載體，通過顯微注射重組靶向NPL基因CRISPR系統(tǒng)至受精卵，并回輸輸卵管得到新生小鼠，通過鼠尾測序驗證NPL基因敲除陽性小鼠。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的所述目的，采用以下實驗技術(shù)方案：

選取可表達(dá)CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)的敲除質(zhì)粒為Px459 vector，設(shè)計靶向NPL基因sgRNA，通過酶切連接得到重組Px459質(zhì)粒。

如上述的重組ICAM-1敲除重組Px459質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，如下步驟：

1）根據(jù)NPL基因CDS區(qū)序列（Chromosome 1 - NC_000067.6），設(shè)計靶向NPL基因sgRNA，得到NPL-sgRNA，序列為GGTGTCCGCGGCGGAATCCG；

2）合成NPL-sgRNA正向及反向寡核苷酸序列，合成時在兩端加上BbsI酶切位點；通過梯度退火形成雙鏈寡核苷酸；

NPL-sgRNA正向及反向寡核苷酸序列為：

正鏈F:CACCGGGTGTCCGCGGCGGAATCCG ；

反鏈R:AAACCCGGATTCCGCCGCGGACACC；

3）將BbsI酶切后的Px459質(zhì)粒載體回收，通過T4連接酶與雙鏈NPL-gRNA連接形成重組基因敲除載體；轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌種單克隆挑取測序得到所需NPL-gRNA/Cas9重組敲除CRISPR載體，即重組Px459質(zhì)粒。