[發明專利]一種寨卡病毒一步法熒光rt-PCR檢測方法及試劑盒

在審

• 申請號: 201810293046.5
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108531647A
• 公開（公告）日: 2018-09-14
• 發明（設計）人: 江振友;顏宇琦
• 申請（專利權）人: 暨南大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/93
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 陳燕嫻

本發明提供了一種寨卡病毒一步法熒光rt?PCR檢測方法及試劑盒。本發明設計了用于檢測該遺傳標志物的特異性引物對和探針，其核苷酸序列分別如SEQ ID NO.1～3所示。本發明還提供了所述的特異性引物對和/或探針的應用、用于檢測寨卡病毒的試劑盒及寨卡病毒一步法熒光rt?PCR檢測方法。本發明的熒光定量PCR反應可在同一反應管內連續進行，操作簡單，并能有效防止污染。所述的檢測方法快速、準確、靈敏，并可消除寨卡病毒和其他黃病毒在血清學檢測上的交叉反應的影響，具有良好的特異性；亦具有廣譜性及廣泛的臨床適應性，具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于生物檢測領域，特別涉及一種寨卡病毒一步法熒光rt-PCR檢測方法及試劑盒。

背景技術

寨卡病毒(ZIKV)是蚊子傳播的黃病毒，其首先于1947年在烏干達從發熱的恒河猴中分離，并且與其他全球相關的節肢動物傳播的人類病原體相關，包括登革熱(DENV)，黃熱病(YFV)，西尼羅河(WNV)，日本腦炎(JEV)和蜱傳腦炎病毒。在過去十年中，ZIKV感染曾在密克羅尼西亞，法屬波利尼西亞、南美洲和中美洲引起大流行病。在大多數情況下，ZIKV感染導致與皮疹和結膜炎相關的自限性發熱性疾病，但也可能導致嚴重的神經系統疾病包括格林-巴利綜合征和腦膜腦炎。尤其孕婦感染值得關注，因為它與嚴重的胎兒畸形異常有關，包括小頭癥，自發流產和胎盤功能不全的子宮內生長限制。

該病毒是全長不分節段單股正鏈ssRNA(+)病毒，包含兩個側翼非編碼區5’NCR和3’NCR。基因組5’端具有典型的甲基化帽子結構用于細胞翻譯，3’末端非多聚腺苷酸化而形成環狀結構。病毒顆粒RNA具有傳染性，同時兼具基因組RNA和病毒信使RNA功能，通過宿主和病毒蛋白酶共同翻譯和翻譯后處理為多聚體蛋白。目前針對寨卡病毒的實驗室診斷方法有病原學方法、血清學方法和針對病毒核酸的檢測技術。

傳統的病原學方法主要通過細胞培養進行病毒的分離，耗時耗力，而且寨卡病毒的毒血癥持續時間短，較難采集到合適的樣品。血清學檢測方法，包括ELISA，免疫熒光、中和試驗等，也被廣泛的應用于寨卡病毒的實驗室檢測。但病毒特異性IgM和中和抗體出現較晚，約發病后1周末期才可檢出，同時黃病毒間交叉反應常見難以鑒別。

發明內容

本發明的第一目的在于克服現有技術的缺點與不足，提供一種用于檢測寨卡病毒的遺傳標記物。

本發明的第二目的在于提供用于檢測寨卡病毒的特異性引物對和探針。

本發明的第三目的在于提供所述的特異性引物對和/或探針的應用。

本發明的第四目的在于提供用于檢測寨卡病毒的試劑盒。

本發明的第五目的在于提供基于所述的特異性引物對和/或探針的寨卡病毒一步法熒光rt-PCR檢測方法。

本發明的目的通過下述技術方案實現：

一種用于檢測寨卡病毒的遺傳標記物，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。此外，本領域技術人員應當理解，該序列的特異性片段也可以作為檢測寨卡病毒的遺傳標記物。

所述的用于檢測寨卡病毒的遺傳標記物在制備檢測寨卡病毒試劑盒中的應用。

本發明根據該保守序列，通過反復對比、篩選，設計了用于檢測該遺傳標志物的特異性引物對和探針。所述的用于檢測寨卡病毒的特異性引物對為：

上游引物序列為：5’-GGTTCTCATCAATGGTTTTGCT-3’；(如SEQ ID NO.1所示)

下游引物序列為：5’-TGGAACAACCATCGCTCGTA-3’。(如SEQ ID NO.2所示)