[發明專利]利用突變蛋白檢測β-內酰胺類抗生素殘留的方法

有效

• 申請號: 201810290742.0
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108642057B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 袁宗輝;程古月;寧佳囡;王玉蓮;彭大鵬;倪騰騰;黃玲利;戴夢紅;陶燕飛;王旭;謝書宇;劉振利;謝長清
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N15/12
• 分類號: C12N15/12;C07K14/705;C12N1/21;C12N15/70;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

1.一種識別β-內酰胺類抗生素殘留的突變蛋白，其特征在于：該突變蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一種識別β-內酰胺類抗生素殘留的突變蛋白，其特征在于：該突變蛋白的蛋白質序列如SEQ ID NO:2所示。

3.一種表達識別β-內酰胺類抗生素的突變蛋白BlaR-CTD的大腸桿菌，所述的大腸桿菌保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO:M2018132。

4.權利要求3所述的大腸桿菌，它是由質粒pET-28a(+)-BlaR-CTD-I188K-S19C-G24C轉化大腸桿菌BL21感受態細胞所得。

5.一種利用權利要求1所述的突變蛋白檢測β-內酰胺類抗生素殘留的方法，所述方法包括：構建突變蛋白表達質粒，對突變蛋白進行誘導表達及純化，建立β-內酰胺類抗生素檢測方法和利用突變蛋白檢測β-內酰胺類抗生素，其特征還包括如下步驟：

（1）以原核表達載體pET-28a(+)-BlaR-CTD為模板，用SEQ ID NO:3-8所示的引物進行PCR擴增得到突變質粒，轉化大腸桿菌BL21感受態細胞，得到保藏號為CCTCC NO:M2018132的大腸桿菌突變菌KCC；

（2）當大腸桿菌突變菌KCC的OD₆₀₀為0.6時，加入終濃度為1 mM的IPTG，18℃恒溫振蕩培養12 h，收集菌液后超聲破碎，取上清進行純化得到高純度的突變蛋白I188K-S19C-G24C，其蛋白質序列如SEQ ID NO：2所示；

（3）將高純度突變蛋白I188K-S19C-G24C包被于酶標板，優化反應條件后進行檢測，考察方法的精密度、靈敏度及特異性；

（4）將步驟（3）建立的檢測方法應用于樣品中β-內酰胺類抗生素的檢測，測定最低檢測限、樣品回收率及變異系數，考察方法的準確度和重復性。

6.權利要求1所述的一種識別β-內酰胺類抗生素殘留的突變蛋白在檢測β-內酰胺類抗生素中的應用。

7.權利要求5所述的方法在可食性動物產品中β-內酰胺類抗生素殘留檢測中的應用。