[發(fā)明專利]利用突變蛋白檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810290742.0
• 申請(qǐng)日: 2018-03-30
• 公開（公告）號(hào): CN108642057B
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁宗輝;程古月;寧佳囡;王玉蓮;彭大鵬;倪騰騰;黃玲利;戴夢(mèng)紅;陶燕飛;王旭;謝書宇;劉振利;謝長清
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C07K14/705;C12N1/21;C12N15/70;G01N33/68;C12R1/19
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務(wù)所(普通合伙) 42001
• 代理人: 張紅兵

本發(fā)明屬于獸藥殘留分析技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用突變蛋白檢測(cè)β?內(nèi)酰胺類抗生素殘留的方法。該蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO：1，在序列的55,70和563?564位存在等位基因突變。公開了如SEQ ID NO：2所示蛋白質(zhì)序列的突變蛋白同時(shí)對(duì)40種β?內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法，包括：突變位點(diǎn)的設(shè)計(jì)，構(gòu)建突變蛋白，對(duì)突變蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)及純化，利用突變蛋白建立β?內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法。本發(fā)明對(duì)35種β?內(nèi)酰胺類抗生素測(cè)定方法提供了最低檢測(cè)限、樣品回收率及變異系數(shù)等技術(shù)參數(shù)，對(duì)本發(fā)明的檢測(cè)方法做了準(zhǔn)確度和重復(fù)性驗(yàn)證分析，本發(fā)明能同時(shí)檢測(cè)35種動(dòng)物性食源產(chǎn)品中β?內(nèi)酰胺類抗生素的殘留量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于獸藥殘留分析技術(shù)領(lǐng)域。具體涉及利用突變蛋白檢測(cè)β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的方法。本發(fā)明 能同時(shí)檢測(cè)同時(shí)檢測(cè)35種動(dòng)物性食源產(chǎn)品中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留量。

背景技術(shù)

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指化學(xué)結(jié)構(gòu)中具有β-內(nèi)酰胺環(huán)的一大類抗生素。近50年來，β-內(nèi)酰胺類抗生素被 用做畜禽的預(yù)防、治療以及促生長。在現(xiàn)代農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，動(dòng)物性食品中該類抗生素的添加以及對(duì)生長發(fā)育 的預(yù)防性治療被認(rèn)為是必不可少的。然而由于該類抗生素的使用不當(dāng)或?yàn)E用造成在動(dòng)物體內(nèi)的殘留，這危 害到動(dòng)物食品安全及人類健康。世界各國對(duì)抗生素的殘留有高度的關(guān)注，在動(dòng)物飼養(yǎng)、生產(chǎn)及銷售過程中， 制定各種相關(guān)法律法規(guī)來規(guī)定抗生素的使用及殘留檢測(cè)。

目前β-內(nèi)酰胺類抗生素已有多種檢測(cè)方法存在，主要為微生物法、理化分析法、免疫分析法及受體分 析法(Ahmed et al.,2017)。微生物學(xué)分析法基于抗生素對(duì)微生物生理機(jī)能和代謝的抑制作用，大多選用枯草 芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌和藤黃八疊球菌等敏感菌株等作為檢測(cè)指示菌，該方法操作簡單、價(jià)格低廉， 適用于基層大量樣品的篩選(Ferrini et al.,2008)，但存在檢測(cè)時(shí)間長、穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，因此很難實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn) 化定量檢測(cè)。理化分析法對(duì)抗生素進(jìn)行定量或定性分析，準(zhǔn)確性高，靈敏度高，但需要昂貴的儀器和專業(yè) 的技術(shù)，而且前處理程序復(fù)雜，不適合基層樣品大規(guī)模的篩選(Gaudin et al.,2001)。免疫分析法是以抗原抗 體的特異性、可逆性結(jié)合為核心反應(yīng)的分析方法，該方法具有快速簡便、靈敏度高、特異性強(qiáng)、處理量大 等特點(diǎn)，但其中抗體制備技術(shù)較為復(fù)雜，且由于抗體的特異性高，只能同時(shí)檢測(cè)一種或少數(shù)幾種抗生素。 抗生素受體分析法是基于抗生素和受體之間的特異性識(shí)別反應(yīng)的分析方法，可以同時(shí)特異性識(shí)別含有具有 活性的β-內(nèi)酰胺環(huán)的青霉素類和頭孢菌素類抗生素，從而實(shí)現(xiàn)抗生素的多殘留檢測(cè)(程古月et al.,2014)。

目前受體分析法在抗生素的殘留檢測(cè)中應(yīng)用較多，如β-內(nèi)酰胺類(Chen et al.,2015,Pazzola et al.,2015)、 四環(huán)素(Moeller et al.,2007)、氯霉素、磺胺類(Gaudinet al.,2012,Liang et al.,2013)等抗生素。該技術(shù)應(yīng)用于 β-內(nèi)酰胺類抗生素的殘留檢測(cè)中的受體蛋白主要種類較多，其中來自肺炎鏈球菌的PBP2x重組蛋白(Zeng et al.,2013)可用于檢測(cè)牛奶樣品中的15種β-內(nèi)酰胺類抗生素，來自肺炎鏈球菌的PBP3重組蛋白(張靜2015) 可用于檢測(cè)牛奶樣品中的27種β-內(nèi)酰胺類抗生素，最低檢測(cè)限(Limit ofDetection,LOD)為0.26-109.46 μg/kg。

本申請(qǐng)人所在的華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家獸藥殘留基準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室前期研究了β-內(nèi)酰胺類抗生素受體的篩選及 ELISA試劑盒研制，構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET-28a(+)-BlaR-CTD，表達(dá)并純化得到高純度的BlaR-CTD蛋白， 以該蛋白為受體建立了牛奶、牛肉、雞肉組織中β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留的檢測(cè)方法，頭孢喹肟的LOD為 0.43μg·L^-1，低于歐盟和我國的MRL(Peng et al.,2013)。然而該研究中蛋白對(duì)氯唑西林、頭孢氨芐、頭孢羥 氨芐的親和力較差，且蛋白的穩(wěn)定性較差。

發(fā)明內(nèi)容