[發明專利]一種玻璃化冷凍液及其冷凍方法

在審

• 申請號: 201810287794.2
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108244100A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 余裕爐;左曉玲;劉洪君;嚴飛;戴甄
• 申請（專利權）人: 成都艾偉孚生物科技有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 成都玖和知識產權代理事務所(普通合伙) 51238
• 代理人: 胡琳梅

本發明屬于輔助生殖領域，具體涉及一種玻璃化冷凍液。本發明的玻璃化冷凍液通過添加紫杉醇作為冷凍保護劑，并結合紫杉醇添加方式，獲得的玻璃化冷凍液處理可提高卵母細胞解凍后體外受精囊胚發育率。將紫杉醇作為冷凍液中的一添加劑能夠起到降低成熟卵母細胞的冷凍損傷和提高受精后胚胎發育能力的作用。并研究紫杉醇添加濃度，獲得本發明添加方式的最適濃度。本發明的玻璃化冷凍液可以大幅度提高成熟卵母細胞冷凍解凍后復蘇率及囊胚發育率，并對細胞超微結構起到保護作用。

技術領域

本發明屬于輔助生殖領域，具體涉及一種添加紫杉醇的玻璃化冷凍液。

背景技術

人類的配子和胚胎的冷凍保存已經是人工生殖領域中一個必要的部分。在過去這二十年中，冷凍保存技術的發展亦可反映人工生殖技術的發展程度。

由于卵母細胞體積大，含水量多，在冷凍過程中極易形成細胞內冰晶對細胞造成機械性損傷，因此卵母細胞保存的關鍵在于減少冷凍過程中細胞內冰晶的形成。冷凍過程中細胞內冰晶形成造成的機械損傷和高濃度的保護液對細胞產生的滲透損傷引起卵母細胞透明帶破裂、硬化，皮質顆粒排放，微管、微絲解聚后難以從組裝，染色體畸變等，這直接影響到解凍卵母細胞的成活率、體外受精率、早期胚胎成活率和妊娠率，甚至影響到后代的健康。

目前的冷凍技術已可用在冷凍保存精子、卵子和不同時期的胚胎，尤其是玻璃化冷凍技術(Vitrification)，其不僅已獲得醫學界廣泛的認可，并漸漸取代傳統慢術冷凍法，而成為冷凍技術的最佳選擇，甚而將此技術運用在高難度的卵子、卵巢組織和人類胚胎干細胞的冷凍上。玻璃化冷凍利用高濃度保護劑溶液在受凍時固化，通過粘度的極度增加的特點，從液態變為無結構的玻璃化狀態，這種玻璃化狀態能保持其溶液狀態分子和離子的分離分布。由于玻璃化冷凍技術快速、低成本，避免細胞內冰晶形成等特點，所以成為卵母細胞冷凍的方法。

雖然許多成熟階段的卵母細胞和未成熟卵母細胞經冷凍處理后均得到了正常后代，但其成功率仍然很低。大多數卵母細胞在玻璃化冷凍過程中都將導致形態及功能上不同程度的損傷。而冷凍造成細胞骨架損傷(微管解聚導致紡錘體紊亂)被認為是冷凍效率降低的重要原因之一。

因此開發一種添加紫杉醇的玻璃化冷凍液，其將對穩定細胞骨架及保護細胞超微結構起到作用，減小玻璃化冷凍過程對細胞的損傷。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的之一在于提供一種紫杉醇在玻璃化冷凍液中的用途，其對于提高卵母細胞的冷凍后的存活率及受精后胚胎發育率發揮作用。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

現有玻璃化冷凍技術在冷凍過程中形成的冰晶對卵母細胞骨架是造成傷害的。目前，許多學者認為紡錘體是影響成熟卵母細胞冷凍效果的一個重要因素。成熟卵母細胞紡錘體由α和β兩種微管蛋白聚合而成，是微管暫時的動力學結構，對于正常成熟分裂、受精、極體排出和原核遷移都是必不可少的。微管的聚合與解聚在特定生理條件下維持著動態平衡，這種平衡很容易受到各種理化變化(如降溫或暴露于冷凍保護劑)的影響。因此微管的形成對環境敏感，并且很容易發生微管解聚，導致紡錘體形成受阻。

紫杉醇作為一種細胞骨架穩定劑，它對微管的結合具有依賴性和可逆性，這一作用降低了聚合所需的微管蛋白的臨界濃度，使動態平衡向著微管裝配的方向移動，促進微管在體外的重新組裝。紫杉醇處理可以大幅度提高成熟卵母細胞冷凍解凍后囊胚發育率，并對細胞超微結構起到保護作用。

本發明提供紫杉醇在玻璃化冷凍液中的用途，對穩定細胞骨架以及提高卵母細胞的囊胚發生率起到作用。

本發明的目的之二在于提供一種添加紫杉醇的玻璃化冷凍液，其對于提高卵母細胞的冷凍后的存活率及受精后胚胎發育率發揮作用。

為實現上述目的，本發明的技術方案為：

在玻璃化冷凍液中添加紫杉醇。