[發明專利]通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結合的方法

有效

• 申請號: 201810287691.6
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN108588208B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: D·邦西蒙;V·克羅凱特;H·古埃;J-F·阿萊曼德;丁方圓
• 申請（專利權）人: 國家科學研究中心;巴黎高等師范學院;索邦大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;韓文華

本發明涉及通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結合的方法。具體地，本發明涉及用于確定蛋白是否結合特異性DNA序列的方法。這種方法特別用于通過特異性識別這些修飾的蛋白(例如，抗體)的結合來鑒定DNA序列的修飾(如甲基化)，也用于鑒定各種蛋白在DNA上的結合序列。

本申請是申請號為201480017389.9，申請日為2014年01月22日，發明名稱為“通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結合的方法”的中國專利申請的分案申請。

技術領域

本發明涉及用于確定蛋白是否結合特異性DNA序列的方法。這種方法特別用于通過特異性識別這些修飾的蛋白(例如，抗體)的結合來鑒定DNA序列的修飾(例如，甲基化)，也用于鑒定各種蛋白在DNA上的結合序列。

背景技術

蛋白與DNA的結合是在生物學中的重要現象；它在調節細胞和病毒功能中具有基本作用。這些包括基本細胞過程，如DNA復制、轉錄、DNA修復和DNA重組、還有DNA修飾或染色體結構的維護。

有幾種蛋白結合到基因組中特定位點來調節基因組的表達和維持。DNA-結合蛋白組成具有多樣化和重要生物學功能的蛋白大家族。DNA-結合蛋白家族是細菌、古生菌和真核生物的各種基因組中最受關注和研究最多的之一。大多數這些蛋白(如真核和原核轉錄因子)含有獨立的折疊單元(結構域)以實現其與DNA輪廓的識別。它們包括重要的基因調節蛋白(稱為轉錄因子及DNA加工蛋白)，如例如DNA和RNA聚合酶、DNA連接酶、DNA解旋酶、DNA內切酶和外切酶、以及DNA修復和重組蛋白。

已證明鑒定這些蛋白結合位點是艱巨的任務。例如，在人類基因組中，有多于700個預測的C₂H₂鋅指轉錄因子(Tadepally等人,BMC Evol.Biol.,8:176,2008)，但這些中只有約10％具有已知結合基序(Matys等人,Nucleic Acids Res.,34:D108-D110,2006)。此外，雖然蛋白結合DNA的熱力學平衡性質是公知的，然而測定其結合和解結合的動力學是更具挑戰性的問題。

使用各種方法，如凝膠移位分析、足跡、和轉錄激活來研究DNA-蛋白相互作用(Carey等人,Cold Spring Harb Protoc,2012(7):733-57,2012)。雖然每種這些方法可提供關于結合的位置或影響的不同信息，它們卻不能提供定量測量特異性結合的簡單方法。熒光偏振/各向異性提供了快速、非放射性方法以直接在溶液中不使用過濾器結合、電泳、或沉淀步驟就能精確測量DNA-蛋白結合(Guest等人,1991；Heyduk和Lee,1990；LeTilly和Royer,1993；Lundblad等人,1996；Royer等人,1992)。

基因組信息指導不同生物分子合成的分子機制一直是過去三十年很多分子生物學研究的重點。以前的研究通常集中在單個基因，使用所得到的一般原理然后為以下提供見解：轉錄、染色質重塑、信使RNA剪接、DNA復制和許多其它基因組加工。盡管在研究其它基因時很多這樣原理似乎有效，然而這些原理通常沒有提供關于基因組范圍對生物功能的見解。另一方面，轉錄和調節信息的系統分析對鑒定基因和調節區是必需的，并且是人類生物學和疾病研究中的重要的資源。這種分析還可以提供對細胞環境、物種和個體中組織和基因變異性(variability)以及調節信息的綜合觀點。

全基因組的努力，例如編碼項目(Encode project)(DNA元件的百科全書(Encyclopedia of DNA Elements))，來鑒定例如在人類基因組中的所有轉錄因子結合位點，這已被證明很麻煩并且是非常勞動密集型的(The ENCODE Project Consortium,Nature,489:57-74,2012)。

因此，仍然需要檢測蛋白/核酸相互作用的簡單而可靠的方法。

發明內容

本發明涉及通過物理操作用于確定蛋白與核酸分子結合的方法。