[發(fā)明專利]通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結(jié)合的方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810287691.6
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN108588208B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: D·邦西蒙;V·克羅凱特;H·古埃;J-F·阿萊曼德;丁方圓
• 申請（專利權(quán)）人: 國家科學(xué)研究中心;巴黎高等師范學(xué)院;索邦大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京戈程知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;韓文華

本發(fā)明涉及通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結(jié)合的方法。具體地，本發(fā)明涉及用于確定蛋白是否結(jié)合特異性DNA序列的方法。這種方法特別用于通過特異性識別這些修飾的蛋白(例如，抗體)的結(jié)合來鑒定DNA序列的修飾(如甲基化)，也用于鑒定各種蛋白在DNA上的結(jié)合序列。

本申請是申請?zhí)枮?01480017389.9，申請日為2014年01月22日，發(fā)明名稱為“通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結(jié)合的方法”的中國專利申請的分案申請。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及用于確定蛋白是否結(jié)合特異性DNA序列的方法。這種方法特別用于通過特異性識別這些修飾的蛋白(例如，抗體)的結(jié)合來鑒定DNA序列的修飾(例如，甲基化)，也用于鑒定各種蛋白在DNA上的結(jié)合序列。

背景技術(shù)

蛋白與DNA的結(jié)合是在生物學(xué)中的重要現(xiàn)象；它在調(diào)節(jié)細(xì)胞和病毒功能中具有基本作用。這些包括基本細(xì)胞過程，如DNA復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、DNA修復(fù)和DNA重組、還有DNA修飾或染色體結(jié)構(gòu)的維護(hù)。

有幾種蛋白結(jié)合到基因組中特定位點來調(diào)節(jié)基因組的表達(dá)和維持。DNA-結(jié)合蛋白組成具有多樣化和重要生物學(xué)功能的蛋白大家族。DNA-結(jié)合蛋白家族是細(xì)菌、古生菌和真核生物的各種基因組中最受關(guān)注和研究最多的之一。大多數(shù)這些蛋白(如真核和原核轉(zhuǎn)錄因子)含有獨立的折疊單元(結(jié)構(gòu)域)以實現(xiàn)其與DNA輪廓的識別。它們包括重要的基因調(diào)節(jié)蛋白(稱為轉(zhuǎn)錄因子及DNA加工蛋白)，如例如DNA和RNA聚合酶、DNA連接酶、DNA解旋酶、DNA內(nèi)切酶和外切酶、以及DNA修復(fù)和重組蛋白。

已證明鑒定這些蛋白結(jié)合位點是艱巨的任務(wù)。例如，在人類基因組中，有多于700個預(yù)測的C₂H₂鋅指轉(zhuǎn)錄因子(Tadepally等人,BMC Evol.Biol.,8:176,2008)，但這些中只有約10％具有已知結(jié)合基序(Matys等人,Nucleic Acids Res.,34:D108-D110,2006)。此外，雖然蛋白結(jié)合DNA的熱力學(xué)平衡性質(zhì)是公知的，然而測定其結(jié)合和解結(jié)合的動力學(xué)是更具挑戰(zhàn)性的問題。

使用各種方法，如凝膠移位分析、足跡、和轉(zhuǎn)錄激活來研究DNA-蛋白相互作用(Carey等人,Cold Spring Harb Protoc,2012(7):733-57,2012)。雖然每種這些方法可提供關(guān)于結(jié)合的位置或影響的不同信息，它們卻不能提供定量測量特異性結(jié)合的簡單方法。熒光偏振/各向異性提供了快速、非放射性方法以直接在溶液中不使用過濾器結(jié)合、電泳、或沉淀步驟就能精確測量DNA-蛋白結(jié)合(Guest等人,1991；Heyduk和Lee,1990；LeTilly和Royer,1993；Lundblad等人,1996；Royer等人,1992)。

基因組信息指導(dǎo)不同生物分子合成的分子機(jī)制一直是過去三十年很多分子生物學(xué)研究的重點。以前的研究通常集中在單個基因，使用所得到的一般原理然后為以下提供見解：轉(zhuǎn)錄、染色質(zhì)重塑、信使RNA剪接、DNA復(fù)制和許多其它基因組加工。盡管在研究其它基因時很多這樣原理似乎有效，然而這些原理通常沒有提供關(guān)于基因組范圍對生物功能的見解。另一方面，轉(zhuǎn)錄和調(diào)節(jié)信息的系統(tǒng)分析對鑒定基因和調(diào)節(jié)區(qū)是必需的，并且是人類生物學(xué)和疾病研究中的重要的資源。這種分析還可以提供對細(xì)胞環(huán)境、物種和個體中組織和基因變異性(variability)以及調(diào)節(jié)信息的綜合觀點。

全基因組的努力，例如編碼項目(Encode project)(DNA元件的百科全書(Encyclopedia of DNA Elements))，來鑒定例如在人類基因組中的所有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點，這已被證明很麻煩并且是非常勞動密集型的(The ENCODE Project Consortium,Nature,489:57-74,2012)。

因此，仍然需要檢測蛋白/核酸相互作用的簡單而可靠的方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明涉及通過物理操作用于確定蛋白與核酸分子結(jié)合的方法。