[發明專利]通過單分子操作來檢測DNA修飾和蛋白結合的方法

有效

• 申請號: 201810287691.6
• 申請日: 2014-01-22
• 公開（公告）號: CN108588208B
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: D·邦西蒙;V·克羅凱特;H·古埃;J-F·阿萊曼德;丁方圓
• 申請（專利權）人: 國家科學研究中心;巴黎高等師范學院;索邦大學
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883
• 代理公司: 北京戈程知識產權代理有限公司 11314
• 代理人: 程偉;韓文華

1.一種用于檢測含有核酸序列的雙鏈核酸分子中至少一個修飾堿基的方法，所述方法包括步驟：

a)提供由雙鏈莖和單鏈環組成的核酸發夾分子，其中雙鏈核酸的末端之一直接或間接地附著到表面，并且雙鏈核酸的另一個末端附著到可移動的表面，其中雙鏈核酸未附著至表面的末端與另一末端共價或非共價相連；

b)施加力以使表面之一從另一個表面移開，從而產生變性的發夾分子；

c)使變性的發夾分子與能夠特異性結合修飾堿基的蛋白接觸；

d)在所述蛋白存在時降低力使發夾分子復性，

其中結合修飾堿基的蛋白引起發夾分子復性的短暫阻斷，

e)檢測由于發夾分子中蛋白與修飾堿基的結合導致的發夾分子復性的短暫阻斷，以及其包括：

1)測量雙鏈核酸分子附著至表面的兩末端之間的距離z；

2)當所述雙鏈核酸分子變性時，測量所述雙鏈核酸分子附著至表面的兩末端之間的距離z_高；以及

3)比較z和z_高；以及

f)通過確定短暫阻斷的位置確定修飾堿基在雙鏈核酸分子中的位置。

2.根據權利要求1所述的方法，其中在步驟c)中進一步提供與所述序列互補的單鏈核酸分子。

3.根據權利要求2所述的方法，其中所述單鏈核酸的長度包括3至50個核苷酸。

4.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟b)中的力高于或等于15pN。

5.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟b)中的力高于或等于17pN。

6.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟b)中的力高于或等于18pN。

7.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟d)中的力降低到少于或等于12pN。

8.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟d)中的力降低到少于或等于11pN。

9.根據權利要求1或2所述的方法，其中步驟d)中的力降低到少于或等于10pN。

10.根據權利要求1或2所述的方法，其中重復步驟a)至f)。

11.根據權利要求1或2所述的方法，其還包括測量阻斷的持續時間。

12.根據權利要求1或2所述的方法，其包括將阻斷的持續時間與不存在蛋白時阻斷的持續時間相比較的另一步驟。

13.根據權利要求1或2所述的方法，其還包括測序所述蛋白結合的核酸序列的步驟。

14.根據權利要求1或2所述的方法，其中可移動的表面是磁珠。

15.根據權利要求1或2所述的方法，其中力是拉力。

16.根據權利要求15所述的方法，其中力是磁力。

17.根據權利要求1或2所述的方法，其中至少一個修飾堿基選自表觀遺傳修飾、錯配或SNP。

18.根據權利要求1或2所述的方法，其中修飾堿基選自4-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、5-羥甲基胞嘧啶、5-甲酰胞嘧啶、5-羰基胞嘧啶、5-羥甲基尿嘧啶和N⁶-甲基腺苷。

19.根據權利要求1或2所述的方法，其中所述蛋白是抗體或能夠結合所述修飾堿基的酶。