[發明專利]一種基于一步法RPA技術檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法

在審

• 申請號: 201810287510.X
• 申請日: 2018-04-03
• 公開（公告）號: CN108456746A
• 公開（公告）日: 2018-08-28
• 發明（設計）人: 邱艷紅;王超楠;張永江;朱水芳
• 申請（專利權）人: 中國檢驗檢疫科學研究院
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 關暢;陳曉慶

本發明公開了一種基于一步法RPA技術檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的方法。本發明提供了用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物對，所述引物對由引物CGMMV?RPA?F和引物CGMMV?RPA?R組成。所述引物對的用途為檢測或輔助檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒或檢測待測植物樣本是否感染黃瓜綠斑駁花葉病毒。本發明提供的引物對具有特異性好和靈敏度高的優點，且本發明的檢測方法具有操作簡單方便和檢測效率高等優點，能滿足口岸和田間檢測的基本需求。

技術領域

本發明屬于植物檢疫技術領域，涉及生物檢測技術，具體涉及一對用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的一步法RPA引物及其在鑒定黃瓜綠斑駁花葉病毒或者檢測植物材料是否感染黃瓜綠斑駁花葉病毒中的應用。

背景技術

黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber green mottle mosaic virus，CGMMV)屬蕪菁花葉病毒科(Tymoviridae)煙草花葉病毒屬(Tobamovirus)，是我國重要的檢疫性有害生物。嚴重威脅葫蘆科作物，是侵染葫蘆科作物的重要病毒之一。目前，CGMMV在全世界30多個國家和地區均有分布。2002年，我國檢疫部門首次從日本引進的種苗中發現了該病毒。隨后，在遼寧、北京、浙江、河北、甘肅、海南等地發生多起進口源性CGMMV，給農業生產造成巨大損失。因此加強對該病毒的檢測鑒定，做好疫情控制對減少我國瓜類作物的損失具有重要意義。

黃瓜綠斑駁花葉病毒屬正單鏈RNA病毒，現有檢測方法主要基于PCR(ThePolymerase Chain Reaction，PCR)技術，如RT-PCR技術或實時熒光PCR技術(real-timepolymerase chain reaction)。然而，PCR技術通常需要配備專用的儀器設備，價格昂貴，操作步驟繁瑣。重組酶聚合酶等溫擴增技術(recombinase ploymerase amplification，RPA)模擬了DNA在生物體內的復制過程，可在常溫下對目標片段進行擴增，因而無需高溫條件對模板進行變性。在RPA過程中，重組酶可催化引物與靶標基因的雜交，并在單鏈DNA結合蛋白的協助下，完成延伸過程。整個反應通常在30min內完成，可操作性強，利于在基層單位的推廣使用，具有廣闊的應用前景。

發明內容

本發明的第一個目的是提供用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物對。

本發明提供的用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的引物對由引物CGMMV-RPA-F和引物CGMMV-RPA-R組成；

所述CGMMV-RPA-F為如下(a1)或(a2)；

(a1)序列表的序列1所示的單鏈DNA分子；

(a2)將序列1經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列1具有相同功能的DNA分子；

所述CGMMV-RPA-R為如下(a3)或(a4)；

(a3)序列表的序列2所示的單鏈DNA分子；

(a4)將序列2經過一個或幾個核苷酸的取代和/或缺失和/或添加且與序列2具有相同功能的DNA分子。

本發明的第二個目的是提供用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的重組酶聚合酶擴增試劑。

本發明提供的用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的重組酶聚合酶擴增試劑含有上述引物對。

上述試劑中，所述引物CGMMV-RPA-F和所述引物CGMMV-RPA-R的摩爾量相同。

本發明提供的用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的重組酶聚合酶擴增試劑還包括Rehydration buffer、MgAc和無菌水。根據需要還可包括陽性對照樣品，所述陽性對照樣品具體可為感染黃瓜綠斑駁花葉病毒的植物葉片。

本發明的第三個目的是提供用于檢測黃瓜綠斑駁花葉病毒的重組酶聚合酶擴增試劑盒。