[發(fā)明專(zhuān)利]用于FBXO32基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810276584.3
• 申請(qǐng)日: 2018-03-30
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108374041A
• 公開(kāi)（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 牛林梅;吳鵬飛;王淑一
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 南京艾迪康醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)所有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專(zhuān)利事務(wù)所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關(guān)壽

本發(fā)明公開(kāi)了一種甲基化檢測(cè)的引物、檢測(cè)方法及其應(yīng)用，包括：(1)特異性擴(kuò)增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO 1的5’端標(biāo)記生物素，以及特異性測(cè)序引物SEQ NO 3；(2)PCR擴(kuò)增反應(yīng)試劑、亞硫酸鹽處理試劑以及焦磷酸測(cè)序相關(guān)試劑。本發(fā)明具有檢測(cè)周期短，特異性高，準(zhǔn)確度高以及低污染風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)，可用于判斷待測(cè)樣本的FBXO32基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，同時(shí)檢測(cè)結(jié)果可指導(dǎo)醫(yī)生進(jìn)行相關(guān)疾病的診斷、治療及預(yù)后評(píng)估。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬生命科學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域，是一種FBXO32基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè) 試劑盒。

背景技術(shù)

DNA甲基化成為表觀遺傳修飾的一個(gè)重要方式，基因啟動(dòng)子區(qū)的CpG島在 正常狀態(tài)下一般是非甲基化的，當(dāng)其發(fā)生甲基化時(shí)，常導(dǎo)致基因轉(zhuǎn)錄沉寂，使一 些重要基因如抑癌基因、DNA修復(fù)基因等喪失功能，從而導(dǎo)致正常細(xì)胞的生長(zhǎng) 分化調(diào)控失常以及DNA損傷不能被及時(shí)修復(fù)，這些機(jī)制與多種腫瘤形成密切相 關(guān)。迄今己發(fā)現(xiàn)許多惡性腫瘤存在一個(gè)或多個(gè)腫瘤抑制基因CpG島甲基化。這 些抑癌基因CpG島甲基化通過(guò)阻止啟動(dòng)子區(qū)的堿基序列與轉(zhuǎn)錄蛋白復(fù)合體及其 他轉(zhuǎn)錄因子相結(jié)合，或通過(guò)甲基化CpG結(jié)合蛋白的介導(dǎo)間接增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄抑制蛋白 的作用，導(dǎo)致相應(yīng)基因的mRNA表達(dá)水平降低或缺失，進(jìn)而下調(diào)蛋白的表達(dá)，最終出現(xiàn)細(xì)胞生長(zhǎng)分化失控，導(dǎo)致癌癥的發(fā)生。

FBXO32、Skpl、Cullin l和Rocl/Rbxl/Hrtl是構(gòu)成泛素蛋白連接酶復(fù)合體的 四個(gè)亞單位。FBXO32是F-box蛋白家族的一員，后三者是泛素連接酶SCF家族 的成員，對(duì)靶點(diǎn)底物的降解依賴(lài)泛素化。有研究稱(chēng)這種泛素化作用通過(guò) MKK6/p38MAPK信號(hào)通路調(diào)節(jié)。F-box蛋白通過(guò)蛋白質(zhì)相互作用區(qū)域與特殊的 底物連接，它通過(guò)F-box區(qū)域與Skpl捆綁再與復(fù)合體相連，參與多種細(xì)胞過(guò)程 例如信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄、細(xì)胞周期進(jìn)程、分化、凋亡、腫瘤形成和細(xì)胞泛素化等。 研究發(fā)現(xiàn)FBXO32可通過(guò)表遺傳機(jī)制使其轉(zhuǎn)錄受到抑制并可能與惡性腫瘤的發(fā) 生及不良預(yù)后有關(guān)。有學(xué)者在晚期卵巢腫瘤中發(fā)現(xiàn)FBXO32的甲基化頻率高達(dá) 29.3％，并且FBX032的高甲基化可影響患者的預(yù)后。此外研究者在賁門(mén)癌中發(fā) 現(xiàn)FBXO32的甲基化頻率高達(dá)44.6％，且與TNM分期有關(guān)。檢測(cè)FBXO32的甲 基化為腸癌的早期診斷提供依據(jù)，同時(shí)對(duì)其治療方案可提供參考，有助于精準(zhǔn)醫(yī) 療的開(kāi)展。

目前對(duì)于FBXO32啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的常規(guī)方法有：甲基化特異性PCR (MSP)、亞硫酸氫鹽測(cè)序PCR(BSP)、甲基化敏感性高分辨率熔解曲線分析 (MS-HRM)、熒光定量法。其中MSP法是使用PCR擴(kuò)增檢測(cè)來(lái)判斷樣本是否 存在甲基化，該法實(shí)用且普遍，但不能做到定量檢測(cè)，并且存在較高的假陽(yáng)性風(fēng) 險(xiǎn)；BSP法主要是通過(guò)PCR聯(lián)合sanger測(cè)序技術(shù)來(lái)檢測(cè)甲基化狀態(tài)，但由于其 操作繁瑣，因此不適合大批量檢測(cè)，同時(shí)挑選克隆的數(shù)目可能會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果， 因此BSP只能算是半定量法；MS-HRM是通過(guò)將單堿基序列的差異轉(zhuǎn)變成熔解 曲線的差異，從而判斷是否存在甲基化，這種方法對(duì)儀器的要求頗高，需要帶 HRM模塊的熒光定量PCR儀，同時(shí)該法只能分析檢測(cè)片段整體甲基化狀態(tài)，而 不能明確每個(gè)CpG位點(diǎn)的甲基化狀態(tài)；熒光定量法是基于MSP開(kāi)發(fā)的技術(shù)，主 要是在檢測(cè)中加入了TaqMan探針，從而保證了較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，但其對(duì) 于多個(gè)甲基化位點(diǎn)的檢測(cè)，也只能做到整體化分析，同時(shí)探針成本較高，因此該 法較適用于少數(shù)位點(diǎn)大量樣本檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于，提供了一種用于FBXO32基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)的引物， 包括一對(duì)特異性擴(kuò)增引物SEQ NO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO1的5’端標(biāo)記生 物素，以及測(cè)序引物SEQ NO 3，其堿基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。