[發明專利]用于FBXO32基因啟動子甲基化檢測的引物、檢測方法及其應用

在審

• 申請號: 201810276584.3
• 申請日: 2018-03-30
• 公開（公告）號: CN108374041A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發明（設計）人: 牛林梅;吳鵬飛;王淑一
• 申請（專利權）人: 南京艾迪康醫學檢驗所有限公司
• 主分類號: C12Q1/6858
• 分類號: C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 浙江杭州金通專利事務所有限公司 33100
• 代理人: 黃素萍;徐關壽

1.用于FBXO32基因啟動子甲基化檢測引物，其特征在于，包括一對特異性擴增引物SEQNO 1和SEQ NO 2，其中SEQ NO1的5’端標記生物素，以及測序引物SEQ NO 3，其堿基序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

2.如權利要求1所述的引物，其特征在于，SEQ NO 1：SEQ NO 2的使用濃度之比為0.5μM：0.5μM。

3.一種FBXO32基因啟動子甲基化檢測試劑盒，其特征在于，包括如下試劑：

(1)亞硫酸鹽處理試劑；

(2)PCR擴增試劑：包括特異性擴增引物SEQ NO1和SEQ NO2；

(3)單鏈純化試劑；

(4)焦磷酸測序試劑：包括測序引物SEQ NO3；

所述擴增引物和測序引物的序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

4.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述亞硫酸鹽處理試劑包括Bisulfite Mix、RNase free water和DNA Protect Buffer。

5.如權利要求3所述的檢測試劑盒，其特征在于，所述單鏈純化試劑包括鏈親和素beads、70％(V/V)乙醇、8mg/ml NaOH溶液、1×Wash Buffer、結合緩沖液和退火緩沖液。

6.權利要求3至5之一所示的FBXO32基因啟動子甲基化檢測試劑盒的使用方法包括：

(i)提取樣本中的DNA；

(ii)將模板DNA進行亞硫酸鹽處理，并純化回收；

(iii)以步驟(ii)中的純化回收產物為模板，依據所述的特異性擴增引物SEQ NO1和SEQ NO 2進行兩輪PCR擴增；

(iiii)將PCR產物進行單鏈純化之后，將其置于焦磷酸測序儀中測序；

(iiiii)依據相關軟件獲得樣本的FBXO32啟動子甲基化狀態；

所述擴增引物和測序引物的序列如下所示：

SEQ NO 1：5’-GGGGTAGTGAGYGAGGTTAGGAG-3’；

SEQ NO 2：5’-AACAAAACCAACCCCCCTCCTAC-3’；

SEQ NO 3：5’-CAACCAAATCAACCTCCC-3’。

7.如權利要求6所述的使用方法，其特征在于，步驟(iii)的所述第一輪擴增條件為：95℃15min預變性；94℃30s，64-56℃30s每循環(-0.5℃)，72℃1min，16個循環；94℃30s，60℃30s，72℃1min，24個循環，72℃10min；所述的第二輪擴增條件為95℃15min預變性；94℃30s，60℃30s，72℃1min，40個循環，72℃10min。

8.如權利要求7所述的使用方法，其特征在于，步驟(iiiii)，包括以亞硫酸鹽處理后的FBXO32啟動子序列為標準序列，并將其輸入甲基化檢測軟件PyroMark CpG，通過該軟件分析獲得樣本的FBXO32啟動子甲基化狀態。