[發明專利]苯丙氨酸羥化酶基因突變譜檢測的特異性引物

在審

• 申請號: 201810273204.0
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108330190A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 龐永紅;彭磊;于洋
• 申請（專利權）人: 徐州市婦幼保健院
• 主分類號: C12Q1/6883
• 分類號: C12Q1/6883;C12Q1/6858;C12Q1/6869;C12N15/11
• 代理公司: 徐州市三聯專利事務所 32220
• 代理人: 陳鵬

本發明公開一種苯丙氨酸羥化酶基因突變譜檢測的特異性引物，屬于分子生物學技術領域，包括13對引物，擴增區域為13個外顯子及其側翼區。本發明的基因引物具有相應的特異性，長度合適，擴增高效，不會形成二級結構和發夾結構，無假引發。利用該引物采用分層研究的方法進行先證者PAH基因突變分析，方法簡單高效、經濟實用。該發明為開展PKU病因分子機制研究提供了方法。

技術領域

本發明涉及一種苯丙氨酸羥化酶基因突變譜檢測的特異性引物，屬于分子生物學技術領域。

背景技術

苯丙酮尿癥(phenylketonuria，PKU)是一種常染色體隱性遺傳病。中國人群中PKU的發病率為1/11000。該病是由于苯丙氨酸羥化酶(phenylalaninehydroxylase，PAH)基因突變導致PAH活性降低或喪失，苯丙氨酸(phenylatanine，Phe)在肝臟中代謝紊亂而致病，嚴重者可引起智力障礙或死亡。該病的確診依靠檢測血清中苯丙氨酸的濃度，正常濃度小于120μmol/L(2mg/dl)，經典型PKU大于1200μmol/L。治療主要是終生低苯丙氨酸飲食。

PKU是第一個被診斷的引起精神發育遲緩的代謝性疾病。早在1934年PKU即被發現，隨后被命名。六十年代，一種簡單的實驗室技術Guthrie細菌抑制實驗應用于新生兒篩查，給患兒的治療帶來了希望。目前中國許多城市已經開展了新生兒PKU篩查，對于確診病例，早期給予低苯丙氨酸飲食，患者的預后大為改善。然而由于基因檢測手段的限制，PKU的病因分子機制的研究卻一直滯后。直到上世紀八十年代，人類PAH基因的cDNA序列被成功克隆，定位于12號染色體，見圖1。GenBank收錄號：NM_000277(mRNA)；U49897.1(cDNA)。這些成果為PKU的分子機制的研究打下了基礎。近年來，隨著基因突變檢測技術的不斷改進，新發現的PAH突變種類也越來越多。截止目前PAH數據庫(http://www.pahdb.mcgill.ca)報道世界范圍內PAH突變種類有567種，我國國內報道的突變種類也有100余種。不同地區、不同民族PAH基因突變譜差異很大，表現出突變的多樣性。例如歐美的PKU人群的高頻率突變集中于外顯子12和11及其側翼區，如R408W、IVSl2+lG>A和IVS10-11G>A。中國PKU人群在第7外顯子及其側翼區，突變頻率最高的p.R243Q。國外的數據不能直接用作國內PKU病因研究的依據。而國內因地區差異，突變情況也各不相同。因此，對一個地區的PKU患者進行PAH全基因突變篩查，建立本地區人群的突變譜十分有意義。目前淮海地區PAH基因突變研究文獻較少。本研究對臨床已確診的101例漢族PKU患兒的PAH基因的13個外顯子及其兩側部分內含子進行突變分析，探討淮海地區漢族PKU患者PAH基因突變類型、頻率及分布特點，該成果雖然不能直接用于PKU的診斷和治療，但豐富了中國漢族人群PAH基因突變數據庫，為開展PKU病因分子機制研究提供依據。

發明內容

針對上述現有技術存在的問題，本發明提供一種苯丙氨酸羥化酶基因突變譜檢測的特異性引物，具有相應的特異性，長度合適，擴增高效，不會形成二級結構和發夾結構，無假引發。該檢測引物為開展PKU病因分子機制研究提供了依據。

為了實現上述目的，本發明設計的一種苯丙氨酸羥化酶基因突變譜檢測的特異性引物，包括13對引物，擴增區域為13個外顯子及其側翼區，將這13個位點命名為C1-C13，具體的引物序列分別為：

所述苯丙氨酸羥化酶基因C1位點，擴增區域為474-533，擴增引物序列是F1:acgaggggcgttactgtg和R1:ccaggaagcaccagcag；

所述苯丙氨酸羥化酶基因C2位點，擴增區域為4614-4863，擴增引物序列是F2:agagttcatgcttgctttg和R2:tggaagtttgctacgacat；