[發明專利]一種酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法

有效

• 申請號: 201810271360.3
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108642130B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 湯曉玲;鄭仁朝;鄭裕國;索慧;劉瀟
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;C12Q1/04;C12N15/70
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，所述方法為：將待測菌株經發酵培養獲得的濕菌體作為待測菌株樣品加入底物反應液中，搖床反應液離心，獲得上清液；取上清液加入顯色反應液中，室溫靜置顯色，在465nm處測吸光值，根據丙酮酸鈉標準曲線，獲得上清液中丙酮酸鈉的含量，進而獲得待測菌株樣品中酪氨酸酚裂解酶的活力，從而篩選出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；本發明方法，可以直接高通量篩選獲得對左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突變體，時間從分析一個樣品需要20min，縮短到分析近60個樣只需1min，所測得的酶活誤差控制在3％以內。

(一)技術領域

本發明涉及一種高通量篩選對左旋多巴合成能力提高的酪氨酸酚裂解酶及其突變體的方法。

(二)背景技術

酪氨酸酚裂解酶(tyrosine phenol-lyase,TPL)又名β-酪氨酸酶，它是一類磷酸吡哆醛(pyridoxal-5’-phosphate,PLP)依賴型裂解酶。TPL能夠催化L-酪氨酸發生α,β-消去反應，生成丙酮酸、苯酚和氨。此反應為可逆反應，若以鄰苯二酚替代苯酚，該酶可催化生成左旋多巴，其催化機理可以用下式表示：

左旋多巴是生物有機體中重要的活性物質，是治療帕金森氏病的主要藥物。其治療帕金森氏病的原理為：左旋多巴的衍生物─多巴胺是治療帕金森氏病的一種重要的神經遞質，但它不能夠通過血腦屏障，因此不能通過外在補充多巴胺來治療帕金森氏病，而左旋多巴能夠通過血腦屏障，到達中樞神經系統，并在體內脫羧酶的作用下，轉變為多巴胺，從而使腦組織中多巴胺含量增加，進而發揮治療帕金森綜合癥的作用。

鑒于左旋多巴植物提取方法產能不穩定、步驟復雜，化學合成工序多、成本高、環境污染嚴重，微生物法合成左旋多巴越來越受到關注。酪氨酸酚裂解酶催化鄰苯二酚，丙酮酸和氨合成左旋多巴具有反應條件溫和、原子經濟性高等顯著優勢。

隨著基因工程技術的快速發展，通過酶高通量篩選、分子改造等技術，可以有效提高酪氨酸酚裂解酶催化合成左旋多巴的效率。由于自然界中存在的酪氨酸酚裂解酶種類繁多，酶分子改造所獲得的突變文庫突變體數量巨大(通常含10⁴～10⁶突變體)，通過傳統的色譜等檢測手段很難高效地篩選獲得催化性能提高的酪氨酸酚裂解酶。因此，建立快速、準確的酪氨酸酚裂解酶高通量篩選方法具有重要意義。

(三)發明內容

本發明為了克服篩選高活力酪氨酸酚裂解酶周期長、工作量大等難題，提供了一種基于深孔板的微型化培養與基于酶標儀微量化檢測的高通量酪氨酸酚裂解酶篩選方法，其機理如下：參與左旋多巴合成的底物丙酮酸鈉在強堿溶液中與水楊醛生成一種顯色的1,5-雙(2-羥苯基)-1、4-戊二烯酮產物，在465nm波長有吸收值。隨著丙酮酸鈉濃度的降低，顏色從橘紅色變為淡黃色。若酪氨酸酚裂解酶的活力越低，說明其合成左旋多巴的能力越弱，丙酮酸鈉的剩余濃度越大，則顯色反應液顏色越深，若酪氨酸酚裂解酶的活力越高，說明其合成左旋多巴的能力越強，丙酮酸鈉的剩余濃度越小，顯色反應液顏色越淺。

本發明采用的技術方案是：