[發明專利]一種酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法

有效

• 申請號: 201810271360.3
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108642130B
• 公開（公告）日: 2021-10-15
• 發明（設計）人: 湯曉玲;鄭仁朝;鄭裕國;索慧;劉瀟
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12Q1/527
• 分類號: C12Q1/527;C12Q1/04;C12N15/70
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述方法為：(1)轉化反應：將待測菌株經發酵培養獲得的濕菌體作為待測菌株樣品加入底物反應液中，在10-30℃、100-300rpm搖床反應20-120min，將反應液離心，獲得上清液；所述底物反應液終濃度組成為：鄰苯二酚2-15g/L，丙酮酸鈉2-20g/L，乙酸銨5-50g/L，亞硫酸鈉0.1-2g/L，EDTA-2Na 0.1-2g/L，磷酸吡哆醛0.2-2mM，pH 7.0-8.0，溶劑為超純水；(2)顯色反應：先后分別加入1ml 250g/L NaOH水溶液，200μL步驟(1)上清液，6.7ml超純水，100μL水楊醛，2ml 250g/LNaOH水溶液，混合均勻，構成10ml顯色反應體系，室溫靜置顯色，在465nm處測吸光值，根據丙酮酸鈉標準曲線，獲得上清液中丙酮酸鈉的含量，進而獲得待測菌株樣品中酪氨酸酚裂解酶的活力，從而篩選出酪氨酸酚裂解酶高活力菌株；所述標準曲線是在待測菌株檢測相同條件下，將底物反應液與含酪氨酸酚裂解酶基因的重組大腸桿菌轉化反應后的上清液進行顯色反應，以丙酮酸鈉濃度為橫坐標，以465nm處吸光值為縱坐標繪制而成。

2.如權利要求1所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述底物反應液終濃度組成為：鄰苯二酚4-8g/L，丙酮酸鈉4-10g/L，乙酸銨30-50g/L，亞硫酸鈉0.5-1g/L，EDTA-2Na 1-2g/L，磷酸吡哆醛0.5-1mM，pH 7.0-8.0，溶劑為超純水。

3.如權利要求1所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述丙酮酸鈉標準曲線按如下方法制備：(1)轉化反應：將含酪氨酸酚裂解酶基因的重組大腸桿菌濕菌體加入底物反應液中，30℃、150rpm搖床反應5min-5h，定時取樣加入1M HCl終止反應后，于3000rpm離心10min，獲得不同反應時間的上清液；所述底物反應液終濃度組成為：鄰苯二酚5g/L、丙酮酸鈉5g/L、乙酸銨50g/L、亞硫酸鈉1g/L、EDTA-2Na 2g/L、磷酸吡哆醛1mM，溶劑為超純水，pH 7.0-8.0；所述濕菌體加入終濃度為4g/L；

(2)顯色反應：依次加入1mL 250g/L NaOH水溶液，200μL步驟(1)不同反應時間獲得的上清液，6.7mL超純水，100μL水楊醛，2mL 250g/L NaOH水溶液，混合均勻，構成顯色反應體系10mL，室溫下放置2h，用酶標儀于465nm測定吸光度，以吸光度為縱坐標，以丙酮酸鈉濃度為橫坐標，獲得丙酮酸鈉標準曲線。

4.如權利要求3所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述含酪氨酸酚裂解酶基因的重組大腸桿菌是將SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的基因導入大腸桿菌獲得的。

5.如權利要求1所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于待測菌株發酵方法為：將待測菌株接種至發酵培養基，在20-37℃，100-300rpm搖床培養6-12h，獲得濕菌體；所述發酵培養基組成為：蛋白胨5-20g/L，酵母粉2-10g/L，氯化鈉2-10g/L，IPTG 10-30g/L，溶劑為水，pH值自然。

6.如權利要求5所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述待測菌株在發酵前先進行種子活化培養，再將種子液以體積濃度2-5％的接種量接種至發酵培養基，所述種子活化培養方法為：將待測菌株接種至種子培養基，在30-37℃，100-300rpm搖床培養10-14h，獲得種子液；所述種子培養基組成為：蛋白胨5-20g/L，酵母粉2-10g/L，氯化鈉2-10g/L，卡那霉素50-100μg/mL，溶劑為水，pH值自然。

7.如權利要求1所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述方法在96孔板中進行反應。

8.如權利要求7所述酪氨酸酚裂解酶高活力菌株的高通量篩選方法，其特征在于所述方法為：(1)將待測菌株接種于裝有種子培養基的深孔板Ⅰ中，于30-37℃，100-300rpm搖床培養10-14h，獲得種子液；(2)將深孔板Ⅰ中的種子液對應地接種到裝有發酵培養基的深孔板Ⅱ中，于20-37℃，100-300rpm搖床培養6-12h；將深孔板Ⅱ放置于孔板離心機，1000-3000×g離心10-30min，棄去上清液；(3)在深孔板Ⅱ中加入100-400μL底物反應液，10-30℃，100-300rpm搖床反應20min-2h，加入100-400μL 1M HCl終止反應；將深孔板Ⅱ放置于孔板離心機，1000-3000×g離心10-30min，獲得上清液；(4)向深孔板Ⅲ先后分別加入1ml 250g/L NaOH水溶液，步驟(3)上清液200μL，6.7ml超純水，100μL水楊醛，2ml 250g/L NaOH水溶液，混合均勻，構成10ml顯色反應體系，室溫下放置20min-2h進行顯色反應，用酶標儀檢測465nm處吸光值，根據丙酮酸鈉標準曲線獲得上清液中丙酮酸鈉的含量，篩選獲得酪氨酸酚裂解酶活力提高的菌株。