[發明專利]一種異枝江蘺原生質體的制備方法

有效

• 申請號: 201810270100.4
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108660105B
• 公開（公告）日: 2020-06-16
• 發明（設計）人: 劉濤;金月梅;劉翠;池姍
• 申請（專利權）人: 中國海洋大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 張黎

本發明公開了一種異枝江蘺原生質體的制備方法，具體步驟為：(1)材料的預處理；(2)配制消化用酶液；(3)將步驟(1)中得到的材料加入步驟(2)配制好的消化用酶液中，放入25?30℃的恒溫搖床上進行黑暗酶解，反應2?3h后，得到酶解液；(4)將步驟(3)中得到的酶解液用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水進行沖洗離心，制得異枝江蘺原生質體。本發明提供的異枝江蘺原生質體的制備方法簡單，原生質體生產效率高，用本發明自制的消化用酶液酶解異枝江蘺可獲得較高密度的原生質體，每克材料可獲得7.7×10⁴個原生質體，為市售酶酶解效率的7?8倍。

技術領域

本領域涉及藻類細胞工程學技術領域，尤其是涉及一種異枝江蘺原生質體的制備方法。

背景技術

異枝江蘺(Gracilaria bailiniae)為紅藻門藻類江蘺科江蘺屬的一種，在中國主要分布在廣東省和海南省沿海，屬熱帶大型海藻藻類，具有生長快、耐高溫的特點，是南方沿海潛在的經濟養殖品種之一。自然界和當前生產中，江蘺主要通過放散孢子的方式進行繁殖，但是傳統的采苗方法耗時長，苗種培育受雜藻的污染影響較大，很難在室內保存，而且容易發生病害。原生質體的分離和培養技術可以有效地避免這些問題。此外，原生質體沒有細胞壁，可用于誘導植株再生、種間細胞雜交、遺傳工程研究等領域。目前，海藻酶解所用酶液一般為動物酶或微生物源酶，眾多的研究表明，不同來源的酶對同一種海藻酶解效果不同，同一種酶對不同種的海藻媒介效果也不同，本發明自制的酶粉在適宜的條件下處理可以獲得大量異枝江蘺的原生質體，且具有較高的效率。目前，缺乏一種酶解效率高的異枝江蘺原生質體的制備方法。

發明內容

為解決上述問題，本發明的目的是提供一種酶解效率高的異枝江蘺原生質體的制備方法。

解釋說明：本發明所述的″I₂-IK溶液″為碘-碘化鉀溶液。

為實現上述技術目的，本發明采用的技術方案如下：本發明的一種異枝江蘺原生質體的制備方法，包括如下步驟：

(1)首先，挑選幼嫩且活力旺盛的藻體，清洗干凈后用0.5g/L I₂-IK溶液浸泡10s，后用大量的消毒海水進行沖洗，并放入消毒海水中暫養后，取出藻體，吸水紙將藻體上水分吸干后用解剖刀將藻體切碎，得到材料；

(2)配制消化用酶液；

(3)將步驟(1)中得到的材料加入步驟(2)配制好的消化用酶液中，所述材料與消化用酶液的質量體積比為1g/10mL，放入25-30℃的恒溫搖床上進行黑暗酶解，每30min鏡檢一次，觀察并拍照，反應2-3h后，得到酶解液；(4)用篩絹對步驟(3)中得到的酶解液進行過濾，去除未消化的細胞、細胞團和碎片，取上清液進行離心處理，使單細胞原生質體下沉，細胞碎片留在上清液中，棄去上清液，用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水進行沖洗離心2-3次，收集沉淀后用含有1mol/L的葡萄糖的消毒海水懸浮至1mL，制得異枝江蘺原生質體。

上述步驟(1)中所述的暫養溫度為24℃，光照強度為3000lx，暫養時間為1-2天。

上述步驟(2)中所述的消化用酶液為：自制纖維素酶與消毒海水的混合液，每10mL消化用酶液由1.5mL的自制纖維素酶和8.5mL的消毒海水組成；所述的自制纖維素酶的制備方法為：配制50mmol/L醋酸緩沖液并調整pH為4.8-5.0，分別按1g/10mL的量加入纖維素酶，充分溶解，并調整自制纖維素酶的最終濃度為2％，即得自制纖維素酶。

上述步驟(3)中所述的材料與消化用酶液的質量體積比為1g/10mL，表示每10mL制備好的消化用酶液加入1.0g材料。

上述步驟(4)中所使用的篩絹目數為200目。

上述步驟(4)中所述的離心的速度為800rpm，離心的時間為10min。