[發明專利]一種全長cDNA合成方法及其測序文庫的構建

在審

• 申請號: 201810269723.X
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108410856A
• 公開（公告）日: 2018-08-17
• 發明（設計）人: 王鄒;章高迪;楊帆;丁瓊;郝升;丁悅;郭靜
• 申請（專利權）人: 武漢光谷創贏生物技術開發有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06
• 代理公司: 杭州千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 裴金華

本發明公開了一種全長cDNA合成方法及其測序文庫的構建。該方法包括以下步驟：（1）Total RNA的提??；（2）將步驟（1）中提取的Total RNA通過Oligo dT引物和長鏈逆轉錄酶的作用下合成第一鏈cDNA；（3）將步驟（2）中第一鏈cDNA作為模板，通過連接酶進行雙鏈接頭的連接；（4）將步驟（3）中的連接有雙鏈接頭的第一鏈cDNA在聚合酶的作用下進行雙鏈富集，得到一種全長雙鏈cDNA。通過該種全長cDNA合成方法得到一種無需進行片段化處理的全長cDNA，構建其測序文庫，同時RNA 5’端不完整或者已降解的序列則不會發生此反應，避免了影響后續分析。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，具體涉及一種全長cDNA合成方法及其測序文庫的構建。

背景技術

NGS測序技術又稱下一代測序，其優點是測序通量高，周期短，成本低。RNA-seq又稱轉錄組測序技術，即用高通量測序技術把編碼RNA、非編碼RNA(noncodingRNA)等或把其中的某些RNA的序列測出來，以檢測它們的表達水平。通常，在構建RNA測序文庫時，首先需要分離純化相關的RNA樣本，然后再將相關的RNA樣本進行片段化處理，并通過逆轉錄合成cDNA，最后通過建庫上機進行測序。Iso-Seq又稱全長轉錄組測序，優點是讀長長，所測數據基本不需組裝，可以直接進行后續相關分析。在cDNA合成過程中，RNA樣本無需片段化處理，直接進行全長cDNA的合成。但是由于目前現有的技術和方法無法識別和區分mRNA樣本的完整性，對于5’端已降解的mRNA也會進行全合成，最終測得的數據會包含全長的轉錄本數據和非全長的轉錄本數據，后續的分析也很難判斷其是否為真正意義上的全長。

發明內容

本發明的目的在于，針對上述現有技術的不足，提出一種全長cDNA合成方法，得到一種全長cDNA，無需片段化處理即可構建測序文庫。

本發明提出一種全長cDNA合成方法，其特征在于：包括以下步驟：

（1）Total RNA的提取；取真核生物的組織、細胞或者血液等樣本，進行總RNA的提取。

（2）將步驟（1）中提取的所述Total RNA通過Oligo dT引物和長鏈逆轉錄酶的作用下合成第一鏈cDNA；第一鏈cDNA鏈的合成是在Oligo dT引物以及長鏈逆轉錄酶的作用下合成，這一步可以將所有的直鏈并帶有poly A 尾的RNA序列信息進行逆轉錄并保護起來，逆轉錄結束后通過過柱純化維持RNA/cDNA雙鏈的穩定。便于后續連接反應的進行。

（3）將步驟（2）中所述第一鏈cDNA作為模板，通過連接酶進行雙鏈接頭的連接；以第一鏈cDNA為模板，依據堿基互補配對原理，在特異的連接酶的作用下，使RNA5’端帶有帽子結構的G與雙鏈接頭的5’凸出末端進行互補配對進行連接。RNA 5’端不完整或者已降解的序列則不會發生此反應。此時雜交雙鏈的兩端都帶有特異的標簽序列，后續基于5’和3’端特異的標簽序列，在聚合酶的作用下進行雙鏈cDNA的富集。

（4）將步驟（3）中的連接有雙鏈接頭的所述第一鏈cDNA在聚合酶的作用下進行雙鏈富集，得到一種全長cDNA。基于5’和3’端特異的標簽序列，在聚合酶的作用下進行雙鏈cDNA的富集。該過程中會涉及到PCR循環數的優化過程，在保證非特異，全面擴增的基礎上獲得足夠的cDNA量。此過程中只有5’端帶有標簽序列的全長cDNA可以進行轉化合成雙鏈cDNA，從而獲得真正意義上的全長cDNA。

進一步的，步驟（1）中采用Trizol提取方式進行Total RNA的提取。Trizol是一種新型總RNA抽提試劑，可以直接從細胞或組織中提取總RNA。其含有苯酚、異硫氰酸胍等物質，能迅速破碎細胞并抑制細胞釋放出的核酸酶。Trizol的主要成分是苯酚。Trizol在破碎和溶解細胞時能保持RNA的完整性，因此對純化RNA及標準化RNA的生產十分有用。