[發(fā)明專利]一種全長cDNA合成方法及其測序文庫的構(gòu)建在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810269723.X | 申請日： | 2018-03-29 |
| 公開（公告）號： | CN108410856A | 公開（公告）日： | 2018-08-17 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 王鄒;章高迪;楊帆;丁瓊;郝升;丁悅;郭靜 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢光谷創(chuàng)贏生物技術(shù)開發(fā)有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/10 | 分類號： | C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 杭州千克知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33246 | 代理人： | 裴金華 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市東湖新技*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 全長cDNA 第一鏈cDNA 測序文庫 合成 構(gòu)建 雙鏈 后續(xù)分析 逆轉(zhuǎn)錄酶 全長雙鏈 聚合酶 連接酶 片段化 長鏈 富集 降解 引物 | ||
1.一種全長cDNA合成方法，其特征在于：包括以下步驟：
（1）Total RNA的提取；
（2）將步驟（1）中提取的所述Total RNA通過Oligo dT引物和長鏈逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成第一鏈cDNA；
（3）將步驟（2）中所述第一鏈cDNA作為模板，通過連接酶進(jìn)行雙鏈接頭的連接；
（4）將步驟（3）中的連接有雙鏈接頭的所述第一鏈cDNA在聚合酶的作用下進(jìn)行雙鏈富集，得到一種全長雙鏈cDNA。
2.如權(quán)利要求1所述的一種全長cDNA合成方法，其特征在于：步驟（1）中采用Trizol提取方式進(jìn)行Total RNA的提取。
3.如權(quán)利要求1所述的一種全長cDNA合成方法，其特征在于：步驟（2）中所述Oligo dT引物序列為5’-TCTCAGGCGTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3’。
4.如權(quán)利要求1所述的一種全長cDNA合成方法，其特征在于：步驟（2）中所述長鏈逆轉(zhuǎn)錄酶來源于M-MLV。
5.如權(quán)利要求1所述的一種全長cDNA合成方法，其特征在于：所述PCR優(yōu)化反應(yīng)體系包含buffer、模板、dNTP Mix、FP、RP、Nuclease-free water和Polymerase。
6.如權(quán)利要求1所述的一種全長cDNA合成方法，其特征在于：步驟（4）中所述全長雙鏈cDNA采用AMPure PB Bead進(jìn)行純化。
7.一種基于如權(quán)利要求1～6所述全長cDNA測序文庫的構(gòu)建，其特征在于：將步驟（4）所述的一種全長cDNA通過DNA修復(fù)酶處理，連接發(fā)卡接頭，得到測序文庫。
8.如權(quán)利要求7所述的一種基于全長cDNA的測序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于：所述測序文庫的測序系統(tǒng)為PacBio RSII或PacBio Sequel。
9.如權(quán)利要求8所述的一種基于全長cDNA的測序文庫的構(gòu)建方法，其特征在于：所述發(fā)卡結(jié)構(gòu)式接頭帶有Barcode序列。
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