[發明專利]一種四環素類抗生素免疫親和柱及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201810269400.0
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108553940A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 柳家鵬;王濤;于蓉;龔利新
• 申請（專利權）人: 山東美正生物科技有限公司
• 主分類號: B01D15/20
• 分類號: B01D15/20;B01D15/22;B01D15/38;B01J20/281;G01N33/531
• 代理公司: 青島高曉專利事務所(普通合伙) 37104
• 代理人: 白瑩;于正河

本發明屬于食品安全檢測技術領域，具體涉及一種四環素類抗生素免疫親和柱及其制備方法和用途，首先將采用環氧氯丙烷活化法活化的瓊脂糖凝膠作為載體，然后將基因重組蛋白G偶聯到載體上，得到了蛋白G?sepharose，再將四環素類抗生素抗體連接到蛋白G?sepharose上，得到了抗體—蛋白G—sepharose，再用交聯劑進行交聯，得到了抗體—蛋白G—sepharose填料，最后將抗體—蛋白G—sepharose填料裝柱后形成了高純度和親和力的四環素類抗生素免疫親和柱，充分利用基因重組蛋白G與四環素類抗生素抗體特異性結合的特點，四環素類抗生素抗體的Fab片段暴露在外，大幅度提高了基因重組蛋白G的抗體結合能力、四環素類抗生素的捕捉能力和四環素類抗生素的純化效率。

技術領域：

本發明屬于食品安全檢測技術領域，具體涉及一種四環素類抗生素免疫親和柱及其制備方法和用途。

背景技術：

親和柱是將與純化對象有專一結合作用的物質連接在不溶性載體上，制成親和吸附劑后所裝的柱，多用做親和層析。

四環素類抗生素(Tetracyclines)是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，包括金霉素(chlortetracycline)、土霉素(oxytetracycline)、四環素(tetracycline)及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素、二甲胺基四環素等，其結構均含并四苯基本骨架；其中四環素、土霉素、金霉素及多西環素以其優良的抗菌性、穩定的藥性及低廉的價格，在畜牧業生產中廣泛用于疾病的治療和預防及促進生長，但該類藥物過量使用會導致畜產品中高濃度藥物殘留，直接影響消費者身體健康，四環素類抗生素的不良反應包括胃腸道反應、二重感染(菌群交替癥)、對骨、牙生長的影響、肝損害、維生素缺乏和腎毒性，此外，四環素類抗生素偶爾還可引起藥熱和皮疹等過敏反應。

四環素類藥物的檢測方法常用的有：微生物法、免疫法和理化檢測法：微生物法包括棉簽(拭子)法、杯碟法、紙片法和TTC法(氯化三苯基氮唑法)，微生物法是目前公認的而又廣泛應用的測定抗生素的方法，根據對抗生素敏感的實驗菌在適當條件下所產生的抑菌圈大小和藥物濃度成比例的關系設計而成，許多發達國家都有一套微生物法快速檢測抗生素藥物在動物織中殘留的方法(程序)，美國和加拿大使用微生物拭子檢測法和快速抗生素篩選實驗法，歐盟常用德國三碟實驗法、歐盟四碟實驗法和新的荷蘭腎實驗法等；免疫法包括酶聯免疫分析法和金標檢測試紙發法，酶聯免疫吸附測定法一般采用間接競爭ELISA方法，在酶標板微孔條上預包被四環素類藥物抗原，樣本殘留的四環素類藥物和微孔條上預包被的抗原競爭抗四環素類藥物抗體(抗試劑)，加入酶標二抗(酶標物)，經TMB底物顯色，樣本吸光度值與其殘留物四環素類藥物呈負相關，檢測樣品中四環素類藥物的含量；理化檢測法包括薄層色譜法、高效液相色譜法和液相色譜質譜聯用法，薄層色譜法可分為正相薄層色譜(NP-TLC)和反相薄層色譜(RP-TLC)兩種方法，已經報道顯示以纖維素、硅膠、硅藻土為吸附劑的薄層色譜方法用于四環素類抗生素的分離,由于四環素類藥物可以與吸附劑中存在的痕量金屬離子形成穩定的絡合物,從而使分離效果較差，高效液相色譜法是最主要的殘留分析方法之一，該方法靈敏度、特異性都非常高，能夠對被測物準確定量，由于四環素容易與金屬離子形成螯合物，并在反相色譜柱的硅醇基上吸附，常常產生拖尾峰，為避免這種情況,常在流動相中加入各種有機酸,如磷酸、草酸或酒石酸等。中國專利201510138304.9公開的四環素類抗生素或其藥用鹽在制備抗EV71型腸病毒藥物中的應用，所述四環素類抗生素為四環素、金霉素、土霉素、地美環素、強力霉素、美他環素、米諾環素或替加環素，所述藥物為局部施用制劑，所述局部施用制劑為軟膏劑，所述藥用鹽為鹽酸鹽；中國專利201610866312.X公開的一種高選擇性四環素類抗生素分子印跡聚合物的制備方法利用模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交聯劑(TRIM,3mL)、引發劑進行高選擇性四環素類抗生素分子印跡聚合物的制備，所述方法包括下述步驟：(1)、制備目標抗生素模板分子；(2)、在容器中加入第一預定量致孔劑；(3)、將所述模板分子、甲基丙烯酸(MAA,6mmol)、交聯劑(TRIM,3mL)、引發劑分別溶入所述致孔劑中；(4)、對所獲得的混合溶液進行超聲脫氣；(5)、對所述混合溶液進行通氮除氧；(6)、封閉所述容器；(7)、將所述容器置于預定溫度的水浴環境中，進行攪拌，使其發生反應；(8)、反應結束后，收集所獲得的聚合物微粒，利用甲醇/乙酸的混合液進行索氏提取，除去模板分子；(9)、利用甲醇對剩余聚合物進行索式提取，以除去乙酸；(10)、將剩余聚合物置于真空干燥箱中干燥至恒重，得到用于對抗生素殘留進行檢測的分子印跡聚合物(MIPs)；中國專利201510019156.9公開的一種四環素類抗生素的納米纖維分子印跡聚合物的制備方法以納米纖維素分子作為支撐載體，對其表面進行硅烷化，以強力霉素為模板分子、乙腈/甲醇為致孔劑、甲基丙烯酸為功能單體、三羥基甲基丙烷三甲基丙烯酸酯為交聯劑、偶氮二異丁腈為引發劑，合成四環素類抗生素的納米纖維分子印跡聚合物，具體包括如下步驟：(1)納米纖維的制備，(2)硅烷化納米纖維的制備，(3)硅烷化納米纖維的變性處理，(4)沉淀聚合法合成納米纖維分子印跡聚合物。