[發明專利]一種四環素類抗生素免疫親和柱及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201810269400.0
• 申請日: 2018-03-29
• 公開（公告）號: CN108553940A
• 公開（公告）日: 2018-09-21
• 發明（設計）人: 柳家鵬;王濤;于蓉;龔利新
• 申請（專利權）人: 山東美正生物科技有限公司
• 主分類號: B01D15/20
• 分類號: B01D15/20;B01D15/22;B01D15/38;B01J20/281;G01N33/531
• 代理公司: 青島高曉專利事務所(普通合伙) 37104
• 代理人: 白瑩;于正河

1.一種四環素類抗生素免疫親和柱，其特征在于主體結構包括柱體、蓋板、進樣口、第一篩板、填料、第二篩板和出樣口；圓管狀結構的柱體的頂部設置有圓形片狀結構的蓋板，蓋板的中心設置有圓管狀結構的進樣口，柱體的內部上部空間為空腔，柱體的內部中間設置有開設有篩孔的圓形片狀結構的第一篩板，柱體的內部下部空間填充有填料，柱體的底部設置有開設有篩孔的圓形片狀結構的第二篩板，第二篩板上設置有上寬下窄的錐形管狀結構的出樣口；填料為腹瀉性貝類毒素抗體-蛋白G-sepharose填料。

2.一種四環素類抗生素免疫親和柱制備方法，其特征在于具體工藝過程包括活化、偶聯、連接、交聯和裝柱共五個步驟：

(一)活化：用蒸餾水充分沖洗濃度為2％的預溶脹瓊脂糖凝膠sepharose4B，洗去瓊脂糖凝膠sepharose4B中殘存的乙醇，蒸餾水與瓊脂糖凝膠sepharose4B的體積比為20:1，用漏斗過濾掉液體，得到濕凝膠，稱取5克濕凝膠與7.5毫升摩爾質量為0.8M的NaOH水溶液、2毫升質量百分比濃度為30％的環氧氯丙烷水溶液和5毫升濃度為2mg/mL的NaBH₄水溶液在溫度為25℃的條件下下進行8小時的搖床反應，反應結束后，用50毫升蒸餾水洗滌濕凝膠，洗去濕凝膠中混雜的環氧氯丙烷，完成瓊脂糖凝膠sepharose4B的活化，活化后的瓊脂糖凝膠sepharose4B作為載體備用；

(二)偶聯：取1克載體用偶聯緩沖液洗滌3次，將載體加入20毫升濃度為2mg/mL的基因重組蛋白G中在室溫條件下偶聯4小時，偶聯緩沖液選取為pH值為8.9的摩爾質量為0.1M的NaHCO₃水溶液和摩爾質量為0.8M的NaCl水溶液的混合液，將偶聯后的載體用pH值為7.4和濃度為20mM的PBS洗滌3次，得到偶聯有基因重組蛋白G的瓊脂糖凝膠sepharose4B，簡稱為蛋白G-sepharose；

(三)連接：將四環素類抗生素抗體溶解于pH值為7.4和濃度為20mM的PBS中，得到10毫升濃度為2mg/mL的抗體，將蛋白G-sepharose用pH值為7.4和濃度為20mM的PBS洗滌3次，PBS的每次使用量為30毫升，將抗體加入到洗滌過的蛋白G-sepharose中在室溫條件下結合30分鐘，得到連接有抗體的蛋白G-sepharose，用pH值為7.4和濃度為20mM的PBS洗滌連接有抗體的蛋白G-sepharose 3次，PBS的每次使用量為30毫升，連接有抗體的蛋白G-sepharose簡稱為抗體—蛋白G—sepharose；

(四)交聯：用pH值為9.0和濃度為0.1M的硼酸緩沖液洗滌抗體—蛋白G—sepharose 3次，硼酸緩沖液的每次使用量為30毫升，在抗體—蛋白G—sepharose中加入pH值為9.0和濃度為0.1M的硼酸緩沖液以及交聯劑，交聯劑為庚二亞氨酸二甲酯，當抗體—蛋白G—sepharose的濃度為20mM時停止交聯劑的加入，使抗體—蛋白G—sepharose、硼酸緩沖液和交聯劑在室溫條件下交聯1小時，加入pH值為9.0和濃度為50mM的乙醇胺終止交聯，并用濃度為50mM的乙醇胺封閉10分鐘，用pH值為7.4和濃度為20mM的PBS洗滌交聯后的抗體—蛋白G—sepharose 3次，得到抗體—蛋白G—sepharose填料；

(五)裝柱：將用10毫升pH值為7.4和濃度為20mM的PBS重懸后的抗體—蛋白G—sepharose填料裝入到柱體1的下部空間中，得到四環素類抗生素免疫親和柱，完成四環素類抗生素免疫親和柱的制備；抗體—蛋白G—sepharose填料的裝入量根據需要制備的四環素類抗生素免疫親和柱的容量選取。