[發明專利]雞傳染性支氣管炎病毒5b ELISA抗體檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810265000.2
• 申請日: 2018-03-28
• 公開（公告）號: CN108680741B
• 公開（公告）日: 2021-05-11
• 發明（設計）人: 任濤;戴旭;吳耀棠;游人榮;林秋燕;廖明
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N33/558
• 分類號: G01N33/558;G01N33/569
• 代理公司: 廣東廣信君達律師事務所 44329
• 代理人: 楊曉松

本發明屬于生物技術領域，涉及一種雞傳染性支氣管炎病毒5b ELISA抗體檢測試劑盒及其應用。該試劑盒包括由重組表達的IBV非結構蛋白5b包被的ELISA反應板，此外還含有稀釋的IgG酶標抗體溶液、封閉液、洗滌液、樣品稀釋液、陽性對照樣品、陰性對照樣品、顯色液和終止液。本發明以非結構蛋白5b作為包被抗原，成本低。本試劑盒的使用具有方便快捷、敏感性高、特異性好等優點，為IBV抗體監測、流行病學調查以及將來對IBV的疾病凈化提供了一種新的有效的檢測手段。

技術領域

本發明涉及以雞傳染性支氣管炎病毒5b蛋白為包被抗原的ELISA抗體檢測試劑盒及其應用，屬于生物技術領域。

背景技術

傳支冠狀病毒(Infectious bronchitis coronavirus,IBV)：傳染性支氣管炎病毒IBV是由套式病毒目，冠狀病毒科，冠狀病毒屬γ冠狀病毒亞屬IBV引起的急性高度接觸性呼吸道疾病，主要以張口呼吸，氣管啰音，咳嗽，腺胃腫大、出血，“花斑腎”為特征。IBV是不分節的單股正鏈RNA病毒，全長約27.6kb，不連續轉錄機制，含有十個明顯的開放閱讀框ORF,5’1a-1b-s-3a-3b-E-M-5a-5b-N-3’。編碼4種結構蛋白S、N、M、E和15種非結構蛋白nsp2-nsp16以及4種附屬蛋白3a、3b、5a、5b。

IBV感染細胞后,在早期RNA聚合酶作用下轉錄出負鏈RNA,在晚期RNA聚合酶作用下以不連續轉錄機制從負鏈RNA轉錄出6種亞基因組mRNA(l-6)。這些mRNA具有共同的3’末端,形成套式結構。其中mRNA2、mRNA4和mRNA6分別編碼IBV三個主要結構蛋白:纖突蛋白(Spike,S)、膜蛋白(Membrane,M)和核蛋白(Nucleocapsid,N)。mRNA5大約由443個核昔酸組成,包含兩個ORF(ORF5a和ORF5b),分別編碼分子量約7.4KDa和9.5KDa的兩種多肽。

不像α和β冠狀病毒nsp1抑制宿主蛋白的合成，γ冠狀病毒IBV沒有nsp1的同源染色體，有文獻證明在γ冠狀病毒IBV中5b代替nsp1抑制宿主蛋白的合成。在冠狀病毒屬中5b的結構和功能均保守。非結構蛋白是在病毒感染復制階段產生的，不參與病毒粒子的組成，滅活的疫苗不具有感染復制能力，也就無法產生非結構蛋白，以非結構蛋白5b作為檢測抗原具有區分滅活疫苗免疫和活毒感染的潛力。

由于當前國內防控IBV主要還是以滅活和弱毒疫苗免疫為主，其中滅活疫苗的免疫效果遠沒有弱毒疫苗的免疫效果好。IBV具有易突變的特性，其中弱毒疫苗可能又會有散毒的風險，這些對于將來IBV疾病的凈化帶來很大的挑戰，所以弱毒疫苗必將隨著技術的發展而淘汰。

現有技術不管是用全病毒蛋白包被還是用非結構蛋白、結構蛋白包被的間接ELISA方法，都不能區分疫苗免疫和活毒感染，因為當前IBV的防控主要還是以滅活疫苗和弱毒疫苗免疫為主，弱毒疫苗在免疫過程中會產生非結構蛋白。所以隨著將來弱毒疫苗退出市場，這里提供一種新的，可選擇的間接ELISA方法來凈化IBV疾病。

發明內容

本發明要解決的技術問題是，克服現有技術中的不足，提供一種用于雞傳染性支氣管炎抗體檢測試劑盒，為臨床IB的診斷和抗體水平的檢測以及將來對IBV疾病凈化提供經濟實用可靠的檢測工具。

為解決上述技術問題，本發明的解決方案是提供一種雞傳染性支氣管炎病毒5bELISA抗體檢測試劑盒，該試劑盒包括：IBV非結構蛋白5b包被的ELISA反應板。

其中，IBV非結構蛋白5b的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示；其氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

作為一種優選的實施方式，IBV非結構蛋白5b是通過重組表達產生的。

作為本發明一種可選的實施方式，IBV非結構蛋白5b重組表達的方法如下：

S1.RT-PCR擴增IBV 5b基因；作為優選的實施方式，擴增IBV 5b基因的引物對如SEQIDNO.3和SEQIDNO.4所示；