[發明專利]一種PTEN-Long蛋白純化制備方法

在審

• 申請號: 201810264951.8
• 申請日: 2018-03-28
• 公開（公告）號: CN108504671A
• 公開（公告）日: 2018-09-07
• 發明（設計）人: 李宏;張謝;譚麟;林劍
• 申請（專利權）人: 寧波市醫療中心李惠利醫院
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C07K14/47;C07K1/14;C07K1/22;C07K1/34;C12N9/16
• 代理公司: 深圳市順天達專利商標代理有限公司 44217
• 代理人: 蔡曉紅;柯夏荷

1.一種PTEN-Long蛋白純化制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

S100.將PTEN-Long質粒轉入感受態細菌，獲得轉入質粒后的感受態細菌的菌落；

S200.挑取若干個所述菌落，對若干個所述菌落中的細菌進行擴增以獲得具有目標細菌濃度的第二菌液，并對所述具有目標細菌濃度的第二菌液中的細菌進行蛋白誘導得到蛋白誘導后的菌體；

S300.裂解所述菌體，獲得初級PTEN-Long蛋白液；

S400.用鎳柱純化所述初級PTEN-Long蛋白液得到二級PTEN-Long蛋白液；

S500.對所述二級PTEN-Long蛋白液進行脫鹽及濃縮以收集所述二級PTEN-Long蛋白液中的PTEN-Long蛋白。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟S100包括以下步驟：

S110.取出-80℃下保存的感受態細菌放入冰水中解凍，抽取100微升解凍后的感受態細菌注入第一離心管，并將在第一離心管內加入10ngPTEN-Long質粒，混合均勻；

S120.將裝有混勻的100微升感受態細菌和10ng PTEN-Long質粒的所述第一離心管冰浴30分鐘，然后放入42℃水浴中熱休克45秒，取出后再冰浴1分鐘；

S130.向所述第一離心管中加入LB液體培養液1ml，將所述第一離心管放置在搖床內，在37℃，200rpm的條件下，緩慢振蕩培養90分鐘，形成所述轉入質粒后的感受態細菌的第一菌液；

S140.取出100ul的所述第一菌液涂在固體培養基中，并將固體培養基倒扣放置在37℃的培養箱中，繼續培養16小時以形成所述菌落。

3.根據權利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟S200進一步包括以下步驟：

S210.在第一錐形瓶中放入50ml濃度為100ug/ml的LB液體培養液；挑取單個所述菌落，接種于所述第一錐形瓶中的LB液體培養液內；將所述第一錐形瓶放置在搖床內，在37℃，150-300rpm的條件下振蕩培養7-20小時，用于對所述菌落中的細菌進行擴增以獲得第二菌液；

S220.在第二錐形瓶中加入400ml,氨芐西林濃度為100ug/ml的LB液體培養液和所述第二菌液8ml，將第二錐形瓶放入搖床內，在37℃，150-300rpm的條件下，振蕩培養1小時30分鐘，用于獲得具有目標細菌濃度的第二菌液；

S230.再向所述第二錐形瓶中加入終濃度為0.1mM-1mM的異丙基硫代半乳糖苷，保持在21℃，150-300rpm的條件下，所述第二錐形瓶在搖床上振蕩誘導3-6小時，用于對所述具有目標細菌濃度的第二菌液中的細菌進行蛋白誘導以獲得第三菌液；

S240.從第二錐形瓶中抽取400mL第三菌液，放入第一離心機中，第一離心機保持4℃，以3000xg的離心速度收集所述菌體。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S210中搖床的轉速為200rpm，振蕩培養的時間為16小時；

步驟S220中，搖床的轉速為200rpm；

步驟S230中異丙基硫代半乳糖苷的終濃度為0.1mM，搖床的轉速為200rpm，振蕩誘導時間為4.5小時。

5.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述目標細菌濃度為490nm波長下的OD值為0.5的細菌濃度。

6.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟S300進一步包括：

S310.取濕重為2g的所述菌體加入20ml的細菌裂解液中，將加入所述菌體的細菌裂解液與0.1％-2％細菌裂解液體積比的聚乙二醇辛基苯基醚和終濃度1mM的苯甲基磺酰氟混合，在冰浴中超聲碎菌3次，每次10分鐘，用于裂解所述菌體，并得到澄清透明的第四菌液；

S320.在所述第四菌液加入終濃度1mM的苯甲基磺酰氟，放入第二離心機中，在4℃和20000xg離心速度的條件下離心30分鐘，抽取上清液，丟棄沉淀，獲得第五菌液；

S330.用濾過膜過濾所述第五菌液獲得所述初級PTEN-Long蛋白液。