[發明專利]混合型熱啟動DNA聚合酶組合物、PCR擴增試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 201810259092.3
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108546749B
• 公開（公告）日: 2022-01-04
• 發明（設計）人: 周嬌嬌;李泓彥;莫顏瑛;張敏
• 申請（專利權）人: 深圳市艾偉迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/686
• 分類號: C12Q1/686
• 代理公司: 廣州華進聯合專利商標代理有限公司 44224
• 代理人: 劉曉玲

本發明公開了一種混合型熱啟動DNA聚合酶組合物、PCR擴增試劑盒及其應用，Taq DNA聚合酶、抗Taq抗體和突變型KOD DNA聚合酶，其中，抗Taq抗體能夠與Taq DNA聚合酶特異性結合，突變型KOD DNA聚合酶與野生型KOD DNA聚合酶相比第147位的組氨酸突變為賴氨酸。實驗結果表明，上述混合型熱啟動DNA聚合酶組合物，用于PCR擴增時錯配率低，具有高效擴增與高保真性的雙重特點，用于擴增時耐熱好，無論是對較長的DNA片段還是低模板量的模板或是高GC含量的模板均具有較好擴增效果。

技術領域

本發明涉及分子生物技術領域，特別是涉及一種混合型熱啟動DNA聚合酶組合物、PCR擴增試劑盒及其應用。

背景技術

PCR擴增(聚合酶鏈式反應)是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，它可看作是生物體外的特殊DNA復制。其原理是利用DNA在體外攝氏95℃高溫時變性會變成單鏈，低溫(經常是60℃左右)時引物與單鏈按堿基互補配對的原則結合。再調溫度至DNA聚合酶最適反應溫度(72℃左右)，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈。

DNA聚合酶(DNA polymerase)是在復制DNA中起關鍵作用的酶。DNA聚合酶主要是以DNA為復制模板，將DNA由5’端開始復制到3’端的酶。目前DNA聚合酶大多數是純化發酵產物得到，或對酶蛋白進行抗體或化學修飾以達到熱啟動。衡量DNA聚合酶保真性的一個通用標準是錯配率，錯配率越低保真性越好。用普通DNA聚合酶對樣品進行擴增的錯配率一般在10^-5堿基/循環數。對于錯配率要求非常嚴格的實驗，如基因篩選、測序、突變檢測等，普通DNA聚合酶遠遠不能滿足要求。新出的KOD DNA聚合酶雖然能夠在一定程度上降低錯配率，然而錯配率仍然有待進一步降低，且KOD DNA聚合酶的聚合能力一般較差，對較長片段的目標DNA很難擴增出來。此外，傳統的DNA聚合酶對于模板量為1pg以下的擴增模板和GC含量較高擴增模板，擴增效果不好，不符合更高靈敏度和準確性的檢測需求。

發明內容

基于此，有必要提供一種對較長片段的目標DNA、或低模板量以及高GC含量的擴增模板均具有較好擴增效果的DNA聚合酶。

此外，還有必要提供一種PCR擴增試劑盒及其應用。

一種混合型熱啟動DNA聚合酶組合物，包括Taq DNA聚合酶、抗Taq抗體和突變型KOD DNA聚合酶，其中，所述抗Taq抗體能夠與所述Taq DNA聚合酶特異性結合，所述突變型KOD DNA聚合酶由野生型KOD DNA聚合酶的第147位的組氨酸突變為賴氨酸得到。

在一個實施方式中，所述突變型KOD DNA聚合酶包括：

(a)由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；或，

(b)在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且具有所述突變型KOD DNA聚合酶活性的由(a)衍生的蛋白質。

在一個實施方式中，所述Taq DNA聚合酶與所述突變型KOD DNA聚合酶的酶活比為1：10U～320U。

在一個實施方式中，所述Taq DNA聚合酶與所述突變型KOD DNA聚合酶的酶活比為1：80U～160U。

一種PCR擴增試劑盒，包括上述任一項所述的混合型熱啟動DNA聚合酶組合物。