[發明專利]一種慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體構建及應用

在審

• 申請號: 201810257388.1
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108441516A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 楊蕊菊;孫子豪;楊興林;潘謳東
• 申請（專利權）人: 和元生物技術（上海）股份有限公司
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N15/66
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種慢病毒CMV?CBh雙啟動子改造載體構建及應用。所述慢病毒載體pLenti?CMV?3FLAG?EGFP?tCBh?mCherry?T2A?Puro由PCR擴增得到tCBh片段替換pLenti?CMV?3FLAG?EGFP?PGK?mCherry?T2A?Puro載體中PGK得到。tCBh啟動子驅動表達mCherry基因和Puromycin抗性基因，可以使用Puromycin篩選出穩定過表達目的基因的細胞；mCherry基因有助于判斷病毒包裝效率以及感染效率，同時也有助于穩定細胞的篩選。通過轉染熒光觀察，證明該慢病毒雙啟動子載體表達系統構建成功，為進一步研究感興趣的目的基因提供基礎載體。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，更具體地說涉及一種慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體構建及應用。

背景技術

雙向啟動子：位于兩個相鄰且轉錄方向相反的基因之間的一段DNA序列。

雙向啟動子在真核生物基因組中廣泛分布，大多數的雙向啟動子缺少TATA盒，而具有較高的GC含量和豐富的CpG島.雙向啟動子雙向起始轉錄，且會對其雙向轉錄的基因在共表達和穩定性表達調控中發揮一定的作用。

在對生物進行轉基因改良的過程中，可能需要將不止一個的外源基因轉入到特定的生物體內，這些外源基因需要在各自相應的啟動子序列的調控下進行表達.由于用于遺傳改良的啟動子數量有限，所以在將多個基因轉入生物體內時經常重復地使用一個特定的啟動子或序列相近的啟動子.這樣雖然可以實現同時轉入多個基因的愿望，但這種載體的構建費時費力.另一方面，因為引入的啟動子序列同源，即使兩個啟動子之間只有90bp的序列同源，導入生物體內就會引起基因表達“共抑制”現象，導致基因轉錄的沉默，這是在轉基因技術中所要面臨的困難和挑戰.

由于雙向啟動子能夠在兩個方向上指導mRNA的生成，這樣在利用雙向啟動子進行轉基因時，可以在其兩端融合某生理或生化過程的兩個基因或多個基因及其組合.這不僅避免了不同基因引入時的繁瑣步驟，減少了引入受體生物中的啟動子數目，更不必擔心引入生物體內的啟動子之間序列同源而導致的轉基因沉默現例子并不多，并且子進行轉基因研究的重點仍然放在雙向啟動子子進行轉基因研究的重點仍然放在雙向啟動子的應用為解決轉基因技術難題提供了可能，在基因工程的應用為解決轉基因技術難題提供了可能，在基因工程研究和應用領域具有不可估量的作用，正成為轉基因技術研究的新領域。

發明內容

下面結合附圖與具體實施方式對本發明作進一步詳細的說明：

1.本發明的內容是構建共用增強子反向雙啟動子慢病毒表達載體

2.本發明采用的技術方案是：

一種慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體構建及應用。所述慢病毒載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR擴增得到tCBh片段替換pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro載體中PGK得到。

3.本發明還涉及構建所述的慢病毒載體的方法，所述方法包括：

(1)片段tCBh的擴增：以質粒pX330A-1x2為模板，設計特異性引物擴增獲得。

所述擴增片段tCBh的引物序列如下：

tCBh-F:5'-ACGAGCTGTACAAGTCTAGATAATCGAGGTGAGCCCCACGT-3'

tCBh-R:5'-TGCTCACCATGGTAAGCTTGGGCTGCAGGTCCAACCTGAAAAAAAGTGATTTC-3'