[發明專利]一種慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體構建及應用在審
| 申請號： | 201810257388.1 | 申請日： | 2018-03-27 |
| 公開（公告）號： | CN108441516A | 公開（公告）日： | 2018-08-24 |
| 發明（設計）人： | 楊蕊菊;孫子豪;楊興林;潘謳東 | 申請（專利權）人： | 和元生物技術（上海）股份有限公司 |
| 主分類號： | C12N15/867 | 分類號： | C12N15/867;C12N15/66 |
| 代理公司： | 暫無信息 | 代理人： | 暫無信息 |
| 地址： | 201321 上海市浦東*** | 國省代碼： | 上海;31 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 慢病毒 目的基因 雙啟動子 載體構建 篩選 雙啟動子載體 慢病毒載體 表達系統 病毒包裝 基礎載體 抗性基因 片段替換 穩定細胞 熒光觀察 啟動子 構建 轉染 應用 改造 驅動 細胞 感染 成功 研究 | ||
1.一種慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體構建及應用，所述慢病毒載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro由PCR擴增得到tCBh片段(序列如SEQ ID No. 3所示)替換pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro(序列如SEQ ID No. 4所示)載體中PGK得到。
2.構建如權利要求1 所述的慢病毒載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro，其特征在于，所述載體的堿基序列如SEQ ID No.5 所示。
3.構建如權利要求1 所述的慢病毒載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro，其特征在于，所述載體結構如圖1所示。
4.構建如權利要求1 所述的慢病毒CMV-CBh雙啟動子改造載體的方法，所述方法包括：
(1) 片段tCBh的擴增：以Addgene采購的 Multiplex CRISPR/Cas9 Assembly SystemKitprotocol 中的pX330A-1x2 質粒. (所述載體結構如圖2所示)為模板，設計特異性引物擴增獲得；所述擴增片段 tCBh的引物序列如下：
tCBh-F: 5'- ACGAGCTGTACAAG
tCBh-R: 5'-TGCTCACCATGGTAAGCTTGGGCT
(2)慢病毒載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-tCBh-mCherry-T2A-Puro的構建：用XbaI 和BspMI酶切載體pLenti-CMV-3FLAG-EGFP-PGK-mCherry-T2A-Puro(所述載體結構如圖3所示)，回收大片段后和tCBh片段進行無縫克隆。
5.如權利要求1 所述的CMV-CBh雙啟動子慢病毒表達載體在慢病毒載體構建中的應用。
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