[發明專利]基于堿基切除修復誘導的檢測Dam甲基轉移酶活性方法

有效

• 申請號: 201810257356.1
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN109251960B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 張會鴿;王莉莉;陳宏麗
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

1.一種非診斷目的基于堿基切除修復誘導的鏈置換和等溫指數擴增熒光檢測Dam甲基轉移酶活性的方法，其特征在于，該方法具體包括以下步驟：

（1）發夾底物DNA、發夾模板DNA、EXPAR模板DNA和信號探針DNA的選取：發夾底物的莖部含有22對完全互補的堿基，其中包括Dam甲基轉移酶的識別序列5’-G-A-T-C-3’，且發夾底物的部分序列與發夾模板的部分序列互補；發夾模板的莖部含有8對互補堿基，為了防止非特異性擴增，發夾模板的3’ 端含有6個突出堿基；EXPAR模板含有兩個完全相同的序列，其中EXPAR模板的延伸產物中包含U堿基；信號探針的兩端分別用羧基熒光素（FAM）和四甲基羅丹明（TAMRA）標記，由于發生熒光共振能量轉移，信號探針以單鏈存在時，熒光猝滅；信號探針的中間位置具有AP位點，且信號探針可與擴增產物雜化形成部分互補的雙鏈；

（2）發夾底物DNA和發夾模板DNA的分別退火；

（3）Dam甲基轉移酶對序列5’-G-A-T-C-3’中A堿基的甲基化；

（4）對甲基化敏感的限制性內切酶（Dpn I）將甲基化的發夾底物進行切割；

（5）鏈置換反應（SDA）產生擴增產物；

（6）等溫指數擴增（EXPAR）循環：以步驟（5）中SDA循環后產生的擴增產物作為指數擴增的引物與EXPAR模板雜化產生大量的擴增產物；

（7）擴增產物與信號探針結合形成部分互補雙鏈DNA，Endo IV識別并切割信號探針上的AP位點，使得FAM熒光信號恢復，且釋放出擴增產物，釋放出的擴增產物繼續與信號探針結合形成雙鏈，Endo IV識別并切割信號探針上的AP位點，該過程可反復循環，使得熒光信號增強并對其進行檢測。

2.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的檢測方法的具體步驟包括：首先退火制備發夾底物和發夾探針，然后在反應試管中加入發夾底物、S-腺甲硫氨酸（SAM）、限制性內切酶（Dpn I）、dam 緩沖、CutSmart? 緩沖以及Dam，在37 °C 反應 2 h，接著 80°C 20 min進行失活，接著，取部分的上述產物于離心管中，加入發夾模板、EXPAR模板、信號探針、Bst DNA聚合酶、尿嘧啶-DNA 糖基化酶（UDG）、核酸內切酶 IV （Endo IV）、ThermoPol緩沖，UDG 緩沖, NEB 緩沖3，dNTPs (dATP，dGTP，dCTP，dUTP)，在37 °C下反應 110 min，最后在494 nm的激發下測定熒光強度。

3.根據權利要求2所述的檢測方法，其特征在于，所述的dam 緩沖由500 mM Tris-HCl,100 mM EDTA, 50 mM β-ME 組成，pH為7.5；CutSmart? 緩沖由100 mM Mg(Ac)₂，500 mMKAc，200 mM Tris-HAc，1000 μg/ml BSA組成，pH為7.9；ThermoPol 緩沖由200 mM Tris-HCl，100 mM (NH₄)₂SO₄， 100 mM KCl, 20 mM MgSO₄， 1% Triton X-100組成，pH為 8.8；UDG 緩沖由200 mM Tris-HCl，10 mM DTT，10 mM EDTA組成， pH 為8.0； NEB 緩沖 3 由1000 mM NaCl，500 mM Tris-HCl，100 mM MgCl₂，10 mM DTT組成，pH為7.9。

4.根據權利要求1所述的檢測方法，其特征在于，所述的發夾底物DNA在緩沖液中的終濃度為100-1000 nM，發夾模板DNA和EXPAR模板DNA在緩沖液中的終濃度為20-200 nM，信號探針DNA在緩沖液中的終濃度為100-1000 nM。

5.根據權利要求1或2所述的檢測方法，其特征在于，其中Dam 甲基轉移酶在緩沖液中的終濃度為0.02-10 U/mL，限制性內切酶（Dpn I）在緩沖液中的終濃度為0-60 U/mL。