[發明專利]基于堿基切除修復誘導的檢測Dam甲基轉移酶活性方法

有效

• 申請號: 201810257356.1
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN109251960B
• 公開（公告）日: 2022-04-26
• 發明（設計）人: 張會鴿;王莉莉;陳宏麗
• 申請（專利權）人: 蘭州大學
• 主分類號: C12Q1/48
• 分類號: C12Q1/48;C12Q1/6844
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 談杰

本發明公開了一種基于堿基切除修復誘導的鏈置換和等溫指數擴增熒光檢測Dam甲基轉移酶活性的方法。該方法操作步驟簡單，具有良好的選擇性和較高的靈敏度。經實驗結果表明，其測定Dam甲基轉移酶的線性范圍為0.02?10U/mL，檢測限為0.014U/mL。該方法還可以用于大腸桿菌細胞中內源性Dam甲基轉移酶的檢測，在大腸桿菌中Dam甲基轉移酶的檢測限為0.61×10^?6mg/mL。

技術領域

本發明屬于生物檢測技術領域，具體涉及一種基于堿基切除修復誘導的鏈置換和等溫指數擴增熒光檢測Dam甲基轉移酶活性的方法。

背景技術

DNA甲基化是一種重要的表觀遺傳現象，在細胞的增殖、衰老和基因表達的過程中起著重要的作用，它通過改變基因的表達來調節細胞的功能。異常的DNA甲基化可導致許多癌癥，如乳房癌、卵巢癌和肺癌等。甲基轉移酶的活性決定了DNA甲基化水平，甲基轉移酶活性的異常比其他癌癥的標志表現得要早一些，因此甲基轉移酶的活性可作為癌癥早期診斷的一個生物標志物。甲基轉移酶可以識別特定的DNA序列，將S-腺苷-L-甲硫氨酸上活躍的甲基轉移到胞嘧啶C-5/N-4或者腺嘌呤N-6的位置。Dam甲基轉移酶能將雙鏈DNA中核酸序列5’-G-A-T-C-3’上的腺嘌呤甲基化形成5’-G-mA-T-C-3’，該甲基化過程在大腸桿菌細胞的增殖，DNA復制以及基因表達等生物過程中起著重要的作用，Dam甲基轉移酶活性的異常可導致大腸桿菌發生病毒性的改變。因此，高靈敏地檢測Dam甲基轉移酶的活性對于疾病的診斷和治療是非常重要的。

傳統檢測Dam甲基轉移酶活性的方法有放射性標記法、色譜法和凝膠電泳，但這些方法存在的缺陷限制其實際應用，如分析步驟繁瑣、儀器設備要求高、需要放射性標記等。后來人們采用新的方法用來檢測甲基轉移酶的活性，如比色法、熒光法、電化學和生物發光法。但這些方法的靈敏度不高，不能用于檢測低濃度的甲基轉移酶。為了提高分析方法的檢測靈敏度，核酸擴增的方法開始被廣泛應用，如鏈置換反應(SDA)、滾環擴增(RCA)和等溫指數擴增(EXPAR)等。盡管基于SDA的比色法已成功用于甲基轉移酶活性的檢測，但靈敏度比較低。與SDA方法相比，RCA方法的靈敏度比較高，但是操作步驟繁瑣，分析時間長。基于限制性內切酶的等溫指數擴增方法雖然擴增效率高，但非特異性擴增不可避免，導致背景升高，降低了分析方法的靈敏度。

發明內容

針對上述問題和現有技術的不足，本發明的目的在于提供一種基于堿基切除修復誘導的鏈置換和等溫指數擴增熒光檢測Dam甲基轉移酶活性的方法，用于高靈敏檢測Dam甲基轉移酶的活性。具體包括：

(1)發夾底物DNA、發夾模板DNA、EXPAR模板DNA和信號探針DNA的選取：發夾底物的莖部含有22對完全互補的堿基，其中包括Dam甲基轉移酶的識別序列5’-G-A-T-C-3’，且發夾底物的部分序列與發夾模板的部分序列互補；發夾模板的莖部含有8對互補堿基，為了防止非特異性擴增，發夾模板的3’端含有6個突出堿基；EXPAR模板含有兩個完全相同的序列，其中EXPAR模板的延伸產物中包含U堿基；信號探針的兩端分別用羧基熒光素(FAM)和四甲基羅丹明(TAMRA)標記，由于發生熒光共振能量轉移，信號探針以單鏈存在時，熒光猝滅；信號探針的中間位置具有AP位點，且信號探針可與擴增產物雜化形成部分互補的雙鏈；

(2)發夾底物DNA和發夾模板DNA的分別退火；

(3)Dam甲基轉移酶對序列5’-G-A-T-C-3’中A堿基的甲基化；

(4)對甲基化敏感的限制性內切酶(Dpn I)將甲基化的發夾底物進行切割，形成一個完全互補的雙鏈DNA和一個發夾結構，該發夾結構不穩定，會自動打開形成單鏈；