[發明專利]一種乳鐵蛋白的液相色譜質譜檢測方法

在審

• 申請號: 201810254892.6
• 申請日: 2018-03-27
• 公開（公告）號: CN108398503A
• 公開（公告）日: 2018-08-14
• 發明（設計）人: 白沙沙;崔亞娟;趙玥;石明楊
• 申請（專利權）人: 北京市營養源研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明涉及一種乳鐵蛋白的液相色譜質譜測定方法，包括：將待測樣品和乳鐵蛋白標準品分別進行胰蛋白酶酶解處理，制成含特異肽段的待測樣品供試液、含特異肽段的乳鐵蛋白標準工作液處理試液；以特異肽段標準品配制特異肽段標準工作液；進行高效液相色譜質譜檢測。本發明以特異肽段外標法定量、乳鐵蛋白標準同時酶解控制酶解系數，能夠測定樣品中非變性和熱變性牛乳鐵蛋白的含量。

技術領域

本發明涉及乳鐵蛋白的測定方法，屬于乳品檢測技術領域。

背景技術

乳鐵蛋白是一種天然的、具有免疫功能的糖蛋白，由轉鐵蛋白轉變而來，晶體呈紅色，大約由700個氨基酸殘基構成，其分子量為80ku，等電點為8.7，可與鐵可逆性結合，主要存在于乳汁中，同時在淚液、唾液、血漿、膽汁、胰液和嗜中性粒細胞中也有存在。乳鐵蛋白在人初乳中含量較高，濃度為6～8mg/mL；奶牛初乳中濃度為1～2mg/mL，而在常乳中含量較低，人常乳中濃度為1～2mg/mL，奶牛常乳中濃度為0.02～0.35mg/mL。不同哺乳階段乳汁中乳鐵蛋白含量不斷變化。

乳鐵蛋白屬于先天免疫系統的活性物質，也被作為一種功效成分-活性蛋白質，在我國，乳鐵蛋白起步相對來說較晚，且其作用主要體現在抑菌方面，但除此之外，乳鐵蛋白還具有殺菌作用，鐵結合能力以及對鐵吸收的促進作用和抗輻射作用等。乳鐵蛋白作為功能性成分，已經被應用到很多領域，諸如食品、醫藥、口腔醫學等方面。

截至目前，國內外還沒有頒布乳鐵蛋白的標準測定方法。乳鐵蛋白的定性和定量檢測方法主要包括酶聯免疫吸附測定法(ELISA)、十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)以及反相高效液相色譜法(RP-HPLC)等。ELISA方法是檢測特定蛋白的有效方法，具有快速、靈敏、簡便、載體易于標準化等優點。結合SDS-PAGE，可用于針對特定抗原的定性和定量檢測。實踐中常利用此種方法檢測生鮮乳及乳制品中的乳鐵蛋白含量。

酶聯免疫吸附測定法(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)可分為測定抗體的間接法、測定抗原的雙抗夾心法及競爭法3種。樣品中乳鐵蛋白含量的檢測一般采用雙抗體夾心法。ELISA法測定乳鐵蛋白的含量具有快速準確、檢測用于常乳、初乳、乳粉、奶酪等乳制品中乳鐵蛋白的檢測。但是此法也有一定的缺陷，在測定樣品前需對樣品進行多次稀釋，且該法所用試劑盒較為昂貴。

十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法(sodium dodecyl suate-polyacrylamide gelelectrophoresis，SDS-PAGE)是一種常見的用于純化和定性分析蛋白質的生物分析方法，有關其定量檢測乳鐵蛋白的應用已有所報道。利用電泳法分離乳鐵蛋白具有設備簡單、費用低廉、操作方法簡單等優點，但它也存在一些缺點，如耗時長、不宜檢測大批量樣品、定量檢測乳鐵蛋白過程較為復雜等。

反相高效液相色譜法(reversed phase highperformance liquidchromatography，RP-HPLC)在國內外有關乳鐵蛋白測定方法的研究中，既有關于利用正相高效液相色譜法測定乳鐵蛋白的報道，也有采用RP-HPLC法測定乳鐵蛋白的相關報道，目前采用RP-HPLC法較為常見，關于液相色譜法測定條件的優化已經存在很多研究。

隨機免疫擴散法(random immune diffusion，RID)即抗原、抗體在瓊脂糖凝膠中自由擴散，兩者在比例適當處相遇，發生沉淀反應。反應的沉淀物因其顆粒較大，在凝膠中不再擴散，形成沉淀帶，沉淀帶的直徑與乳鐵蛋白的濃度呈正比，用染色液將沉淀帶染色，準確測量出環的直徑，通過標準曲線圖計算出試驗樣品中乳鐵蛋白的濃度。

分光光度法是通過測定物質在特定波長處或一定波長范圍內光的吸收度，對該物質進行定性和定量分析的方法。用分光光度法測定乳鐵蛋白濃度對儀器設備的要求較低，可以快速地測定乳鐵蛋白的含量，適用于工廠中分離純化過程中的快速檢測或者對檢測結果準確度要求不高的樣品的分析，但其準確性比較差。

有鑒于此，特提出本發明。