[發明專利]一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法

在審

• 申請號: 201810253700.X
• 申請日: 2018-03-26
• 公開（公告）號: CN108330156A
• 公開（公告）日: 2018-07-27
• 發明（設計）人: 蕭宏穎
• 申請（專利權）人: 上海數儒生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/02
• 分類號: C12Q1/02;G01N27/447
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

1.一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法，其特征在于：包括如下過程：

SS01、檢測細胞存活度：

具體包括評估蘭花生長點萃取液對皮膚細胞是否具細胞毒性，評估蘭花生長點萃取液對皮膚細胞型態變化，評估皮膚細胞周期；

SS02、評估蘭花生長點萃取物之保護因紫外線及氧化傷害而造成的DNA損傷：

具體包括蘭花生長點萃取物保護環狀DNA效應評估、蘭花生長點萃取物保護片段化DNA效應評估；

SS03、評估蘭花生長點萃取物修護因紫外線造成皮膚細胞損傷：

具體包括評估萃取物修護皮膚細胞經紫外線作用后細胞存活度、評估偵測DNA損傷之環丁嘧啶二聚體生成量。

2.根據權利要求1所述的一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法，其特征在于，所述SS01中檢測細胞存活度中評估蘭花生長點萃取液對皮膚細胞是否具細胞毒性的過程如下步驟：

S011、皮膚細胞培養：取人類皮膚角質株化細胞培養在96孔培養板中，并96孔培養板放在37℃以及5％CO₂培養箱中培養至少24小時；

S012、萃取液配置：取冷藏備用的蘭花生長點萃取物并配置成不同濃度梯度的萃取液；

S013、細胞毒性評估：向S011中的96孔培養板加入S012配置的不同濃度的萃取液，反應后移除培養液，并用無菌PBS清洗一次后重新加入培養液以及10ul的MTT溶液反應，在37℃以及5％CO₂培養箱中培養反應4小時后移除培養液，加入100μL的DMSO溶解甲臢沉淀物，最后于波長570nm下測定吸光值。

3.根據權利要求1所述的一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法，其特征在于，所述SS01中檢測細胞存活度中評估蘭花生長點萃取液對皮膚細胞型態變化的過程如下步驟：

S014取人類皮膚角質株化細胞培養在96孔培養板中，并96孔培養板放在37℃以及5％CO₂培養箱中培養至少24小時；

S015向S014中的96孔培養板加入1μL的萃取物，在不同時間梯度反應后，于顯微鏡下觀察細胞形態并拍照記錄。

4.根據權利要求1所述的一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法，其特征在于，所述SS01中檢測細胞存活度中評估皮膚細胞周期的過程如下步驟：

S021、取人類皮膚角質株化細胞培養在24孔培養板中培養至少24小時；

S022、加入10μL蘭花生長點萃取物，于培養箱中反應；

S023、反應后取出上清液和細胞，并放入離心管中以1200rpm離心5分鐘；移除上清液，加入300μL的PBS，緩慢震蕩并逐滴加入700μL酒精固定細胞后移至微量離心管中，置于4℃冰箱儲存；

S024、將微量離心管以1200rpm離心5分鐘，移除上清液，依序加入445μL的PBS，5μL濃度為10mg/ml的核糖核酸酶A以及50μL濃度為10％的聚乙二醇辛基苯基醚，于37℃反應30分鐘將人類皮膚角質株化細胞的RNA破壞分解后，以1200rpm離心5分鐘并移除上清液后，加入400μL的PBS混合均勻后再加入5μL濃度為5mg/ml的聚酰亞胺溶液于4℃的溫度下避光反應5分鐘，以過濾膜過濾；

S025、使用流式細胞分析儀并配合Winmdi軟件分析細胞周期分布比例。

5.根據權利要求2-4任意一所述的一種大白蘭花生長點萃取物安全性檢測方法，其特征在于，所述人類皮膚角質株化細胞在96孔培養板中的細胞密度為1×10⁴/well。